Özgüllük, çapraz reaktivite ve girişim
İki bölgeli immünometrik deneylerde, çapraz reaktan antikorlardan biri veya her ikisi ile reaksiyona girebileceğinden, potansiyel çapraz reaktanları analitin yokluğunda ve varlığında test etmek önemlidir. Her iki antikorla reaksiyon, sinyalde bir artış sağlarken, bir antikorla reaksiyon, yalnızca analitin varlığında tespit edilebilen yüksek çapraz reaktan konsantrasyonlarında sinyalde bir azalmaya neden olabilir.
Yapısal olarak ilişkili bileşiklerin, konjugatların veya metabolitlerin çapraz reaktivitesi, steroid deneylerinde özel bir problemdir. Bazı durumlarda, örn. Plazmada kortizol ve testosteron, doğrudan bir yöntem rutin olarak kullanılır (ancak sınırlamalar akılda tutulmalıdır).
Diğerlerinde, örn. idrarda kortizol, bazı tahlillerde preanalitik bir ekstraksiyon adımı gereklidir, ancak bunun gerekli olduğu durumlar vardır, örn. konjenital adrenal hiperplazi tanısından şüphelenilen bebeklerde 17-hidroksiprogesteron tayini sırasında potansiyel çapraz reaktanları uzaklaştırmak içindir.
Klinik numunelerdeki görünüşte ilgisiz maddelerden kaynaklanan enterferans çeşitli şekillerde ortaya çıkabilir. Digoksin tedavisine bakılmaksızın, belirli koşullara sahip hastaların serumunda oluşan, kötü karakterize edilmiş digoksin benzeri immünoreaktif madde olarak adlandırılan madde(ler) digoksin testlerinde yanlış yüksek sonuçlar verir ve tesadüfi çapraz reaktivite gibi görünmektedir.
Otoantikorlar, in vivo otoantikor tarafından sekestre edilen ve dolayısıyla makroprolaktin durumunda olduğu gibi biyolojik olarak aktif olmayan tahlil analite katkıda bulunarak müdahale edebilir. Alternatif olarak, otoantikorlar tahlil reaksiyonunda yer alabilir; sonuç üzerindeki etki, test tasarımına bağlı olacaktır (örneğin, serbest tiroid hormonları için yapılan testlerde anti-triiyodotironin ve anti-tiroksin).
Bazı analitler için, otoantikorlardan interferans oluşumu, örneklerin taranmasını gerektirecek kadar sıktır, örn. tiroglobulin testi için veya otoantikorun çıkarılmasından sonra yeniden test, örn. prolaktin.
Kompleman bağlanması, antijen-antikor kompleksinin tahrip olmasına yol açabilir. Bu etki, kalsiyum iyonlarını şelatlamak için EDTA ilavesiyle önlenebilir. Anti-hayvan antikorları, insan serumundaki diğer türlerin immünoglobulinlerine karşı antikorlar, örn. insan anti-fare antikorları (HAMA) ve heterofilik antikorların artık hastaların yüksek bir kısmında meydana geldiği bilinmektedir, HAMA görüntüleme ve terapötik amaçlarla monoklonal antikor verilen hastalarda büyük miktarlarda mevcuttur.
Anti-hayvan antikorları ve muhtemelen romatoid faktör, tek bir antikora bağlanarak onun antijenine olan afinitesini azaltabilir veya iki antikoru çapraz bağlayarak antijeni taklit edebilir. Çok yüksek konsantrasyonlar, yüksek doz kanca etkisine benzer bir şekilde negatif enterferans üretebilir.
Bu etkiler, reaktif antikorlarla aynı hayvan türünden immünoglobulinlerin eklenmesiyle bloke edilebilir. Kit üreticileri artık rutin olarak fare ve diğer türlerden immünoglobulinleri ve reaktif antikor formülasyonlarına spesifik antikor blokerlerini dahil etmektedir.
Bir enterferansın varlığı için basit bir test, benzer matrisin bir seyrelticisi ile seyreltmede doğrusallığın incelenmesidir. Doğrusallığın olmaması bir soruna işaret eder, ancak iyi doğrusallık bir sorunu dışlamaz.
Yüksek Doz Kanca Etkisi
İki antikorun numuneye aynı anda eklendiği iki bölgeli bir immünometrik tahlilde (tek adımlı bir tahlil), analit konsantrasyonu çok yüksek olduğunda ve antikorlar artık fazla olmadığında, yakalama ve etiketli antikorların çapraz bağlanması analit tarafından azaltılacak, her antikor üzerindeki bağlanma bölgeleri ayrı analit molekülleri tarafından işgal edilecektir.
Bu nedenle gözlemlenen sinyal azaltılacaktır. Aşırı yüksek analit konsantrasyonlarında, sinyal üst kalibratörün altına düşebilir ve hatalı olarak düşük bir sonuç okunur.
Bu fenomen, yüksek doz kanca etkisi veya iki fazlı yanıt olarak bilinir ve insan koryonik gonadotropini gibi tümör belirteçlerinde görüldüğü gibi, yalnızca klinik olarak birkaç büyüklük mertebesinde bir konsantrasyon aralığında meydana gelen analitler için önemli olacaktır. -fetoprotein ve prolaktin. Kancanın konumu, antikorların konsantrasyonlarına bağlıdır.
Bu etkinin olası oluşumuna karşı sürekli tetikte olmak zordur, ancak yanlış (belki de görünüşte “normal”) bir sonuç uygunsuz ve muhtemelen zararlı eylemlerin yapılmasına yol açabileceğinden, uygulanabilir her türlü çaba gösterilmelidir.
Standart eğrinin üst kısmındaki değerlerle veya uygun klinik bilgileri olan numunelerin rutin dilüsyonu, örn. ‘büyük hipofiz tümörü’ bazen kullanılır. Hamilelik testi için olanlar gibi bireysel cihazlar da savunmasızdır.
Kanca etkisi, örneğin katı faz yakalama antikoru ile inkübe edildiği, fazla analitin yıkanarak uzaklaştırıldığı ve etiketli antikorun daha sonra eklendiği iki aşamalı bir format kullanılarak önlenebilir. Bu formatta, çok yüksek konsantrasyonlar, ne kadar büyük olduğuna dair hiçbir gösterge olmaksızın “en yüksek kalibratörden daha büyük” olarak okunacaktır.
Bununla birlikte, ekstra adım, tümör belirteçleri için bazı önemli bir faktör olan tahlilin genel belirsizliğini arttırır. Reaksiyon zamanında çok erken bir kinetik okuma uygulayabilen sistemler, nihai sonucun bir “tahmini”, otomatik seyreltme ve yeniden tahlili mümkün kılarak bu sorunu neredeyse ortadan kaldırır.
İyon Seçici Elektrotlar
Çoğu geleneksel klinik biyokimya ölçüm biçiminin temeli, renkli bir bileşiğin üretilmesidir. Elektrokimya, ölçümün bir voltaj (potansiyel) veya akım üretimine dayanması ve ölçüm sisteminin bir fotometre yerine bir voltmetre veya ampermetre olması bakımından farklıdır.
Belirli bir analite özel olarak yanıt veren bir elektrokimyasal dedektöre iyon seçici elektrot (ISE) adı verilir. Erken elektrotlar iyonlara yanıt verdi, bu nedenle adı, ancak daha yakın zamanlarda, ortak bir teknolojiyi paylaştıkları için genellikle aynı kategoriye dahil edilmelerine rağmen, glikoz ve üre gibi metabolitlere yanıt veren elektrotlar geliştirilmiştir. Klinik alanlarda kullanılan glikoz sensörleri genellikle ISE cihazlarıdır ve tüm kritik bakım analiz cihazları ISE teknolojisine dayanmaktadır.
ISE’lerin temeli, analitteki değişikliklere potansiyometrik (voltaj değişikliği) veya amperometrik (akım değişikliği) yanıt üretmeleridir, yani iki tip birincil elektrot vardır.
İkincil elektrotlar, spesifikliği elde etmek ve bir ISE tarafından tespit edilebilen bir ürünü serbest bırakmak için enzimler gibi diğer özellikleri kullanır. Elektrotlar bir dizi klinik uygulamada kullanılmaktadır.
En sık kullanılan elektrotlar:
- İyonlar: ör. hidrojen (pH), sodyum, potasyum, klorür, florür, kalsiyum, magnezyum, lityum, amonyum (NH+4).
- Gazlar: ör. oksijen, karbondioksit, amonyak (NH3). İkincil veya karmaşık elektrotlar: örn. glikoz, üre, laktat, kreatinin.
- ISE’lerin klinik uygulamalardaki avantajları şunlardır:
- Fotometrik olmayan, yani optik olarak berrak bir çözeltiye ihtiyaç duyulmaz, yani tam kan kullanılabilir.
- Hızlı ve doğrudan, gerçek konsantrasyonun veya biyolojik aktivitenin ölçülmesine izin verir.