Polimorfizm – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
DNA probları kullanılarak RFLP’lerin saptanmasıyla HLA tiplemesinin uygulanabilirliği ilk olarak Wake ve tam uzunlukta bir DR1 cDNA klonu kullanarak HLA-DR bölgesi polimorfizmlerini bildirmiştir. DR , DQ ve DQ için tam uzunlukta cDNA probları kullanılarak HLA-DR ve -DQ alellerinin RFLP tiplemesi, o zamandan beri RFLP’ler ile serolojik veya hücresel tanımlanmış HLA sınıf II arasındaki ilişkiyi doğru bir şekilde tanımlama girişiminde yaygın olarak kullanılmıştır.
Kısıtlama Parçası Uzunluğu Polimorfizmi
RFLP analizi, genellikle “buffy coat” lökositlerinden elde edilen genomik DNA örnekleri üzerinde gerçekleştirilir. Tam uzunluktaki DNA, lökositlerin sodyum dodesil sülfat (SDS)/proteinaz K sindirimi yoluyla özütlenir ve kısıtlama endonükleaz Taq-1 veya MSP-1 kullanılarak kısıtlama sindirimine tabi tutulur.
Öz, daha sonra %2’lik bir agaroz jel üzerinde elektroforetik olarak ayrılır ve bir Southern blot tekniği kullanılarak bir nitroselüloz membrana aktarılır. Kısıtlama parçası desenleri, daha sonra X-ışını filmine maruz bırakılan ücretsiz radyo-etiketli cDNA probları ile lekenin hibridizasyonu ile görselleştirilir.
Üretilen hibridizasyon sinyal modelleri daha sonra farklı HLA-DR ve -DQ spesifikliklerinin tanımlanmasını sağlamak için referans tablolarla karşılaştırılır.
Bu tekniğin avantajları, birden fazla numunenin (>30) aynı anda işlenebilmesidir. Ayrıca, DR , DQ ve DQ alelik özgüllükleri tek bir numuneden tanımlanabilir, çünkü kısıtlama sindirmeleri bir HLA genine özgü cDNA (örn. farklı HLA özgüllüğüne sahip bir cDNA ile ilgilidir. (örneğin, DQ veya DQ).
Dezavantajları, RFLP’nin son derece dikkatli numune işleme ve DNA ekstraksiyonu gerektirmesidir. DNA tam uzunlukta olmalı, kısmen bozulmamalıdır, çünkü bu, kısıtlama modelini kökten değiştirerek yanlış bantlamaya neden olabilir. Ek olarak, sonuçların alınması 3 hafta kadar sürebileceğinden, doğal zaman kısıtlamaları nedeniyle HLA tipi kadavra donörlerine klinik nakil ortamında kullanılamaz.
Ayrıca, kısıtlama parçası bantlama modelleri oldukça karmaşıktır ve cDNA problarının interlokus çapraz hibridizasyonu, bu tekniğin yorumlamada önemli bir uzmanlık gerektirdiği anlamına gelir. Bununla birlikte, ikinci sorun, kısa bölge veya eksona özgü cDNA problarının kullanılmasıyla aşılabilir.
Oop polimorfizm nedir
Polimorfizm Nedir Tıp
Polimorfizm ne demek
Kimyada polimorfizm nedir
Malzemede polimorfizm nedir
Polimorfizm nedir C
Java polimorfizm Nedir
Heterozigot polimorfizm Nedir
Teknik terimlerle, RFLP analizi, HLA antijenlerini kodlayan bölgedeki polimorfik DNA dizilerini doğrudan tanımlamaz, ancak bunlarla güçlü bağlantı içindeki kısıtlama bölgelerini tanımlar.
Ek olarak, benzer RFLP modelleri gösteren belirli HLA-DR alellerini ayırt etmek için HLA-DR ve HLA-DQ alelleri arasındaki bağlantı dengesizliğine dayanır; DR6’dan (DQ6) DR3 (DQ2) ve DR9’dan (DQ9) DR7 (DQ2).
Belirli HLA-DR-DQ çağrışımları her zaman aynı olmadığı için, Kafkas kökenli olmayan popülasyonları analiz ederken böyle bir çalışma çok dikkatli olmalıdır. Gerçekten de, daha sonraki kanıtlar, bu tür ilişkilerin Kafkasoid popülasyonlarında da her zaman doğru olmadığını göstermiştir.
Polimeraz Zincirleme Reaksiyonu
Şu anda, MHC alellerini tanımlamanın en uygun yöntemi, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) olarak bilinen bir teknik kullanmaktır. Bu, belirli genomik DNA dizilerini seçici olarak kopyalamanın hızlı bir yöntemidir. Belirli bir MHC geninin polimorfik eksonu gibi spesifik DNA bölgelerini büyütmek için, ilgilenilen bölgeyi çevreleyen DNA dizisini tamamlayıcı sentetik oligonükleotit primerleri sentezlenmelidir.
RFLP analizi ile aynı prosedürde ekstrakte edilen genomik DNA daha sonra iki sentetik oligonükleotidin aşırı konsantrasyonlarının varlığında yüksek sıcaklıkta denatüre edilir. Soğutma daha sonra DNA iplikçiklerinin yeniden tavlanmasını sağlar, böylece her iki primer de genomik DNA üzerindeki tamamlayıcı dizilerine bağlanır.
Reaksiyona eklenen Thermus aquaticus bakterisinden elde edilen termostabil enzim DNA polimeraz (Taq-polimeraz), şimdi iki primer arasındaki genomik DNA’yı şablon olarak kullanarak primeri uzatır.
Çoğaltılan DNA daha sonra yüksek sıcaklıkla tek iplikler halinde denatüre edilir ve karışım yeni tavlama ve replikasyon döngülerini kolaylaştırmak için soğutulur. İlk uzatma ürününün uzunluğu rastgeledir, ancak sonraki tüm döngüler, şablon ilk primerde bittiği için tanımlanmış uzunlukta ürünler oluşturur. Döngüler daha sonra dizileme için yeterli DNA bulunana kadar tekrarlanır.
Belirli bir alel ile ilişkili DNA dizi seviyesinde tanımlandıktan sonra, farklılıkların meydana geldiği bölgelerden oligonükleotid probları oluşturulabilir. Bu diziye özgü oligonükleotit (SSO) veya alele özgü oligonükleotit (ASO) probları daha sonra, PCR-SSO/PCR-ASO adı verilen bir teknik kullanılarak Southern lekeli PCR ile büyütülmüş spesifik hedef DNA’ya hibridize edilebilir.
Bu tür teknikler hızlı, ucuz ve MHC gen yapısını tanımlamanın hassas bir yoludur. Bununla birlikte, PCR-SSO/ASO tipleme teknikleri, her lokustaki her alel için en az bir prob olmak üzere, çoklu blotların ve etiketli probların hazırlanmasını gerektirir. RFLP tiplemesi, aksine, en fazla iki leke ve üç sonda gerektirir.
PCR-SSO/ASO’nun kullanıldığı zaman kısıtlamaları DNA-RFLP’ye benzer ancak hedef DNA’nın hazırlanması daha hızlıdır (24 saate kıyasla 5-6 saat); benzer miktarda zaman alan lekeleme ve sondalama. Bu nedenle, RFLP gibi, bu teknik de yalnızca acil olmayan klinik uygulamalarda kullanılır ve bu nedenle HLA tipi kadavra donörlerinde kullanılamaz.
Moleküler tekniklerle HLA tiplemesi, yakın zamanda PCR tabanlı çoklu diziye özgü primer (PCR-SSP) yönteminin tanıtılmasıyla devrim yaratmıştır. Hem HLA sınıf I hem de sınıf II genlerinin yoğun moleküler klonlanması, eksiksiz bir SSP serisinin oluşturulmasını kolaylaştırmıştır.
PCR-SSP, hem PCR reaksiyon koşullarının katılığı hem de Taq polimerazın primer dizisiyle uyumsuz olan hedef DNA dizilerini büyütme yeteneğinden yararlanan oligonükleotid primerlerinin tasarımı ile her bir primer çiftinin alelik özgüllüğünü korur. DNA ve primer arasındaki tamamlayıcılığın tamamlandığı reaksiyonlarda amplifikasyon verimi %100’dür ve hedef DNA replike edilir.
Hedef DNA ile primerin 30 ucu arasında bir veya daha fazla baz çifti uyumsuzluğu olduğunda, amplifikasyon verimliliği %0’dır ve hiçbir ürün sentezlenmez. HLA sınıf I ve sınıf II tipleme için bu sistem, HLA-A, -B, -C, DR 1, DR 3, DR 4, DR 5 ve DQ 1 genlerini tanımlamak için 192 PCR reaksiyonu kullanır. Reaksiyon ürünleri, etidyum bromür içeren %1 agaroz jel kullanılarak elektroforetik olarak ayrılır ve bir UV transillüminatör üzerinde görselleştirilir.
Heterozigot polimorfizm Nedir Java polimorfizm Nedir Kimyada polimorfizm nedir Malzemede polimorfizm nedir Oop polimorfizm nedir Polimorfizm ne demek Polimorfizm nedir C Polimorfizm Nedir Tıp