Çift Sarmal – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
Metodolojiye Genel Bakış
Tüm hücre içi PCR teknikleri, hücre içinde ya doğrudan ya da bir in situ (IS) hibridizasyon adımını takiben saptanabilen çift iplikli veya tek iplikli DNA/cDNA amplikonları yaratmaya çalışır. Hücrelerin yeterli sindirimi (amplifikasyon reaktiflerine erişime izin vererek) ile amplifiye ürünün hücresel bölme içinde lokalizasyonunun korunması ve doku/hücre morfolojisinin korunması arasında ince bir denge sağlanmalıdır.
Çözelti fazı PCR’de meydana gelene benzer şekilde, bireysel hücre seviyesinde spesifik döngüsel termal değişiklikler meydana gelmelidir. İlk adım, eğer biri bir DNA hedefini amplifiye ediyorsa, çift sarmallı DNA’nın (dsDNA) tek sarmallı forma (ssDNA) denatürasyonunu içerir.
RNA hedef spesifik amplifikasyonu için, RNA şablonu zaten tek ipliklidir ve bir cDNA şablonu oluşturmak için ters transkripsiyon gerçekleştirilir.
İkinci olarak, primerler daha sonra istenen hedef dizinin ilgili uçlarına tavlanır ve daha sonra bir in situ ligaz zincir reaksiyonu (IS-LCR) olan DNA ligaz kullanılarak uzatmak veya bağlanmak için termostabil bir enzim (Taq DNA polimeraz veya Klenow fragmanı) kullanılır.
Spesifik Taq polimerazlar, daha yüksek konsantrasyona ve daha büyük birim polimeraz aktivitesine sahip olan IS-Taq polimeraz dahil hücre içi PCR analizlerinde kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Sonraki termodöngü turları, bir nükleik asit amplifikasyon reaksiyonunda istenen hedef dizinin kopya sayısını arttırır.
Hücre içi amplifikasyon reaksiyonlarında amplifiye edilen ürün miktarında üstel bir artış hiçbir zaman elde edilemez ve çoğu durumda lineer amplifikasyon meydana gelir. Bunun nedeni, hücrenin nükleer kompartmanının (dsDNA ssDNA premRNA ve histon proteinlerini içeren) kompaktlığı nedeniyle, amplifikasyon reaktiflerinin istenen nükleik asit dizisine erişilebilirliği sorunları nedeniyle tekniklerin göreli verimsizliğidir.
Amplikon oluşturulduktan sonra algılama gerçekleştirilmelidir. Etiketli bir primer veya nükleotid kullanılırsa, amplikon etiketlenir ve doğrudan immünositokimyasal tekniklerle gösterilebilir. Ancak genel olarak, doğrudan etiketli nükleotid ve etiketli primer yaklaşımları, spesifik olmayan sinyal oluşumu ve PCR amplikonuna spesifik olmayan etiket eklenmesi nedeniyle büyük ölçüde terk edilmiştir.
Alternatif olarak ve daha kabul edilebilir bir şekilde, bir IS hibridizasyon adımı (tek sarmallı bir oligo probu veya çift sarmallı bir genomik prob kullanılarak), standart IS hibridizasyon kinetiğinin genel kurallarına bağlı kalarak ve sıkı post-amplifikasyon uygulanarak amplifikasyon sonrası gerçekleştirilir.
dna’nın ikili sarmal yapısı
Watson Crick
İKİLİ Sarmal
Dna sarmalı Nedir
DNA nın keşfi
Watson Crick DNA modeli
dna’nın çift sarmal yapısı ve özellikleri
dna’nın ikili sarmal yapısını kim bulmuştur
Hücre İçi PCR Teknolojileri
Aşağıdakiler dahil olmak üzere literatürde çeşitli teknikler tanımlanmıştır:
DNA in situ PCR (IS-PCR): PCR reaksiyon karışımı içinde etiketli bir nükleotid (örn. dUTP) kullanılarak doku örneklerindeki hücresel DNA dizilerinin PCR amplifikasyonu. Etiketli ürün daha sonra, geleneksel yerinde hibridizasyon veya immünositokimya için olduğu gibi standart saptama teknikleri kullanılarak saptanır. Bu teknolojinin kullanılması önerilmez.
Etiketli primer tahrikli in situ amplifikasyon (LPDISA): PCR reaksiyon karışımı içinde etiketli bir primer kullanılarak DNA dizilerinin amplifikasyonu. Etiketli ürün daha sonra DNA IS-PCR için olduğu gibi saptanır. Bu teknolojinin kullanılması önerilmez.
PCR in situ hibridizasyon (PCR-ISH): Doku örneklerinde hücresel DNA dizilerinin PCR amplifikasyonu, ardından amplifiye edilmiş ürünün etiketli bir dahili veya genomik prob kullanılarak in situ hibridizasyon tespiti. Kullanılan etiketler ya izotopik (örn. 32P, 35S) ya da izotopik olmayan (örn. biotin, digoksigenin, floresein) olabilir.
Ters transkriptaz in situ PCR (RT in situ PCR): önce ters transkriptaz (RT) kullanarak bir kopya DNA şablonu (cDNA) oluşturarak ve ardından yeni oluşturulan DNA şablonunu DNA için olduğu gibi çoğaltarak hücrelerde ve doku örneklerinde mRNA dizilerinin amplifikasyonu IS-PCR. Bu tekniğin yine spesifik olmayan etiket dahil edilmesiyle ilgili doğal sorunları vardır ve hücrelerde ve doku bölümlerinde RNA şablonlarının analizi için kullanılmamalıdır.
Ters transkriptaz PCR in situ hibridizasyon (RT- PCR–ISH): ters transkriptaz (RT) kullanılarak bir cDNA şablonu oluşturularak hücre ve doku örneklerinde RNA dizilerinin amplifikasyonu. Yeni oluşturulan cDNA daha sonra amplifiye edilir ve amplikon, PCR-ISH’de olduğu gibi dahili bir oligonükleotit ile problanır.
PRINS (primer in situ amplifikasyon) ve döngüsel PRINS: tek iplikli PCR ürünü oluşturmak için bir primer kullanılarak metafaz kromozom yayılımlarında veya interfaz çekirdeklerinde spesifik genetik dizilerin amplifikasyonu. Birçok amplifikasyon turu kullanılıyorsa, bu teknik, döngülü PRINS olarak adlandırılır.
Yerinde PNA PCR (IS-PNA-PCR) ve PCR-PNA-ISH: IS-PNA-PCR, bir DNA taklit molekülü, peptit nükleik asit (PNA) kullanılarak DNA hedeflerinin amplifikasyonunu ifade eder. PNA, amid bağlarıyla bağlanan tekrarlayan N-(2-aminoetil)-glisin birimlerinden oluşan basit bir moleküldür.
Purin (A ve G) ve pirimidin bazları (C ve T), metilen karbonil bağları ile omurgaya bağlanır. PNA, primer olarak kullanıldığında Taq DNA polimeraz tarafından uzatılmaz ve bu nedenle nokta mutasyonlarının ayırt edilmesine ve doğrudan bireysel hücre haplotiplenmesine izin veren primer dışlama deneylerinde kullanılabilir.
PNA kullanan ikinci reaksiyon, PCR-PNA-ISH’dir; burada, amplifikasyonun ardından in situ hibridizasyon adımı için 15-20 mer’lik bir PNA probu kullanılır. PNA’lar, DNA oligo problarından daha yüksek Tm’lere (erime sıcaklıkları) sahiptir ve bir PNA-DNA dupleksindeki tek nokta mutasyonları, karşılık gelen DNA-DNA uyumsuzluğu dupleksine kıyasla Tm’yi yaklaşık 15 C düşürür.
IS-TaqMan PCR: standart PCR’de olduğu gibi geleneksel bir primer çifti kullanılarak DNA dizilerinin amplifikasyonu. Ancak, amplifikasyon karışımına dahili bir TaqMan probu eklenir. Probun 50 ucuna bir floresan raportör molekülü (FAM, HEX, vb.) yerleştirilir. 30. uçta, bir söndürücü molekül (yine floresan, genellikle TAMRA) konumlandırılır.
Prob bir kez lineer hale getirildiğinde ve bozulmadığında, söndürücünün raportör moleküle yakınlığı, raportör molekülden herhangi bir floresansa izin vermez. Taq DNA polimerazları, reaksiyon için önemli olan iki özelliğe sahiptir: (a) Taq DNA polimerazın Y konfigürasyonunda tek bir ipliği kaldırmasına izin veren Y-şeritli çatal yer değiştirmesi; ve (b) haberci molekülü TaqMan probunun 50 ucuna bağlayan bağlayıcı kolun bölünmesine neden olan 50-30 endonükleotik aktivite yapılır.
Yerinde alel spesifik amplifikasyon (IS-ASA): Bu teknik, PCR’nin 30. ucunda yapay olarak oluşturulmuş baz çifti uyumsuzluklarını kullanarak insan DNA dizilerindeki nokta polimorfizmlerini tespit etme yeteneğine sahip amplifikasyon refrakter mutasyon sistemi (ARMS) PCR’sini kullanır. primerler. Primer dizisine uyan polimorfizm mevcutsa, tercihen bu dizinin amplifikasyonu gerçekleşecektir.
DNA nın keşfi Dna sarmalı Nedir dna'nın çift sarmal yapısı ve özellikleri dna'nın ikili sarmal yapısı dna'nın ikili sarmal yapısını kim bulmuştur İKİLİ Sarmal Watson Crick Watson Crick DNA modeli