İnce Tabaka Kromatografisi (TLC)
Prensipler
TLC, 1960’larda kağıt kromatografisinin yerini aldı ve şimdi kendisinin yerini büyük ölçüde HPLC alıyor. TLC’de sabit faz (genellikle alümina, silika jel veya selüloz) bir cam, plastik veya metal plaka üzerine kaplanır. Plakanın bir ucuna uygulanan bir çözücü karışımı (hareketli faz), kılcal çekim ile plaka boyunca hareket eder ve plakaya uygulanan bir numunede çözünen maddelerin kromatografik olarak ayrılmasına neden olur.
Floresan olmadıkça, çoğu bileşik, görselleştirilmelerini sağlamak için türevlendirmeye (kimyasal modifikasyon) ihtiyaç duyacaktır: bu, tipik olarak, kromojenik reaktifler ile püskürtme veya plakaya daldırma yoluyla elde edilir.
Kalitatif bilgi, plakayı görüntüleyerek basitçe elde edilebilir ve tek tek noktaların tanımlanması, tutma faktörünün ölçülmesiyle elde edilebilir (Rf, noktanın kat ettiği mesafe, çözücü cephesi tarafından kat edilen toplam mesafeye bölünür).
Plaka ikinci kez çalıştırılarak daha yüksek çözünürlük elde edilebilir, ancak çözücü yönü ilk çalıştırmada 90’a eşittir (iki boyutlu TLC). 2-D TLC’nin dezavantajı, her plakaya sadece bir numunenin uygulanabilmesidir.
Kantitasyon, ya plakayı tarayabilen bir yoğunluk ölçer kullanımını ya da noktanın durağan fazdan elüsyonunu ve ardından kolorimetrik ölçümü gerektirir. Ancak 2-D TLC, proteomik alanındaki gelişmelerle birlikte yeniden ilgi görmüştür.
2-D TLC’yi takiben, tek tek proteinlere karşılık gelen noktaların modeli, belirli bir hastalığı olan bireyler ve kontroller arasında karşılaştırılır ve ilgili spesifik proteini tanımlamak için gruplar arasında yoğunlukta farklılık gösteren noktalar plakadan ayrıştırılır.
Uygulamalar
TLC, diğer kromatografik yöntemlere kıyasla nispeten hızlı, ucuz ve kolay olduğu için günümüzde ağırlıklı olarak bir tarama tekniği olarak kullanılmaktadır. Bir klinik laboratuvarda TLC uygulamaları, amino asitlerin, ilaçların ve karbonhidratların tahlillerini içerir.
Amino Asitler
Fenilketonürili çocukların erken tespiti için birçok ülkede yenidoğan tarama programları mevcuttur. Fenilalanin için spesifik spektrofotometrik veya HPLC yöntemleri mevcut olmasına rağmen, birçok tarama laboratuvarı, diğer amino asit bozukluklarının, örn. tirozinemi, akçaağaç şurubu idrar hastalığı vb.
Anormal şekilde yükseltilmiş bir amino asidin kimliğinin teyidi daha sonra 2-D TLC veya HPLC, örn. Akçaağaç şurubu idrar hastalığında anormal şekilde yükselmiş dallı zincirli amino asitlerin (lösin, izolösin ve valin) karakteristik modelidir.
Özellikle kütle spektrometrisi (LC–MS; daha sonra bakınız) ile kombinasyon halinde sıvı kromatografisi ile bağlantılı teknolojideki son gelişmeler, yenidoğan tarama programlarında TLC kullanımında bir azalmaya yol açmıştır.
İnce tabaka kromatografisi
TLC kromatografi
İnce tabaka kromatografisi SORULARI
Kağıt kromatografisi ve ince tabaka kromatografisi arasındaki farklar
Kolon ve ince tabaka kromatografisi
Kolon kromatografisi
İnce tabaka kromatografisi Deneyi
Adsorpsiyon kromatografisi
İlaçlar
İdrar ilaç taraması, bazik, nötr ve asidik bileşikleri içeren, ‘eğlence amaçlı’ kullanım için mevcut olan veya kasıtlı veya kazara aşırı dozda alınan ilaçların çeşitliliği nedeniyle karmaşıktır. Bilinci kapalı veya koopere olmayan hastada, spesifik ilaçların tüketimi hakkında çok az bilgi bulunabilir.
TLC genellikle ilk tarama ve ticari sistemler için tercih edilen tekniktir, örn. Toxilab1, mevcuttur. Bunlar, sistemlerden herhangi birine dahil edilen nötr ilaçlarla asidik ve bazik ilaçlar için ayrı plakalara ve solvent sistemlerine sahip olma eğilimindedir.
Farklı kromojenik reaktiflerin ardışık olarak püskürtülmesi, farklı ilaçların farklı renklerle boyanmasına neden olur ve böylece daha kolay tanımlamaya izin verir. Ancak son yıllarda, kötüye kullanılan ilaçların birinci basamak taraması için otomatik analizörlerde enzim immünolojik testlerinin kullanımına yönelik önemli bir hareket olmuştur.
Karbonhidratlar
TLC, karbonhidrat metabolizması bozuklukları, örn. fruktozüri, vb. Bu uygulama için sadece kalitatif sonuçlar gereklidir, ancak ağızdan tatbik edilen şekerler kullanılarak gastrointestinal sistem fonksiyonu ve bütünlüğü için testlerin geliştirilmesi, şekerlerin kantitatif TLC’sine ihtiyaç duyulmasına neden olmuştur.
Bir örnek, mide-bağırsak yolunun duvarını farklı mekanizmalar yoluyla geçen mono- ve disakkaritlerin (ksiloz, ramnoz, 3-0-metilglikoz ve laktuloz) kullanılmasıdır. Gastrointestinal sistem hastalıklarının ayırıcı tanısıdır.
Emilim için uygun olan bağırsak yüzeyindeki azalma (örneğin çölyak hastalığı) monosakkarit emiliminde ilerleyici bir azalmaya yol açarken, bağırsak duvarının bütünlüğünün zarar görmesi (örneğin Crohn hastalığında) disakkarit emiliminde bir artışa yol açar.
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC)
Prensipler
HPLC, klinik laboratuvarda kullanılan en yaygın kromatografi şeklidir. Gelişmiş performans, katı fazı dar sütunlarda (tipik olarak 150 5 mm) içererek ve hareketli fazı basınç altında (tipik olarak 1.5-2.0 atmosfer basıncı) kolondan pompalayarak elde edilir.
HPLC’de zaman zaman iyon değişimi veya boyut dışlama ayırma mekanizmaları kullanılsa da, çoğu yöntem moleküllerin katı faza adsorpsiyonuna dayanır. Normal fazlı HPLC’de, bir silika paketleme malzemesinin yüzeyindeki hidrofilik bağlanma grupları hidrofilik molekülleri çeker ancak hidrofobik molekülleri çekmez, ters fazlı HPLC için bunun tersi doğrudur.
Bu nedenle, normal faz HPLC’de artan polariteye sahip bir mobil faz, polar molekülleri katı fazdan daha etkin bir şekilde uzaklaştırırken, ters fazlı HPLC’de giderek artan hidrofobik (organik) mobil fazlar, polar olmayan molekülleri katı fazdan daha kolay uzaklaştırır. Bu nedenle, ters fazlı HPLC, biyolojik sıvılarda baskın olan yüksüz moleküllerin ayrılması için özellikle uygundur.
HPLC için ekipman
Bir HPLC sisteminin bileşenleri şunları içerir: bir pompa(lar), numune yerleştirme sistemi (şırınga enjektörü veya otomatik numune alıcı), kolon, dedektör ve veri toplama sistemi (tablo kaydedici veya bilgisayar). Çoğu uygulama için, sabit bir akış hızında (tipik olarak 1-2 ml/dak), yani izokratik elüsyonda tek bir sıvı faz kullanılabilir.
Bununla birlikte, ayrılmakta olan bileşiklerin yapı olarak benzer olduğu bazı karmaşık uygulamalarda, analiz sırasında sıvı fazın bileşiminin değiştirilmesi, yani gradyan elüsyonu gerekli olabilir. Gradyan elüsyonunun bir örneği, kan veya idrardaki amino asitlerin ayrılmasıdır.
HPLC için saptama yönteminin seçimi, rutin olarak kullanılan ultraviyole (UV), floresan ve elektrokimyasal (EC) saptama ile analitin türüne bağlıdır. UV tespiti, ters fazlı HPLC’de baskındır, ancak mobil fazdaki yüksek organik çözücü konsantrasyonu 190 ile 230 nm arasında büyük bir arka plan absorpsiyonu ile sonuçlandığından, normal faz yöntemlerinde nadiren kullanılır.