Bu, şu anda kullanımda olan en popüler serolojik testtir. Metodolojide birçok varyasyon vardır, ancak hepsi antijenin genellikle bir polistiren veya polivinil plaka veya boncuk olan katı bir faza bağlanmasını içerir. Hastanın serumu eklenir ve antikorun katı fazda antijene bağlanmasına izin vermek için uygun bir süre sonra, spesifik olmayan bağlanmış materyal ve fazla serum yıkanarak çıkarılır.

Daha sonra bir enzimle (konjugat) konjugasyonla etiketlenmiş bir anti-insan immünoglobulin eklenir. Konjugat, antijen-antikor kompleksindeki antikora bağlanır. Fazla konjugat daha sonra yıkanır ve bağlı etiketli anti-insan immünoglobulinin varlığı, etiketleme enzimi için uygun bir substratın eklenmesiyle saptanır.

Uygun reaksiyonlar meydana gelirse, substrat ışığı emen bir ürüne dönüştürülür ve renkli görünür. Antikor yokluğunda renk üretilmez. Rengin yoğunluğu doğrudan antijene bağlanan antikor miktarı ile ilgilidir.

Renk değişimi çıplak gözle ölçülebilir veya bir spektrofotometre ile okunarak reaksiyonun tam gücünü verir. Yaygın olarak kullanılan enzim substrat sistemleri yaban turpu peroksidaz (HRP) O-fenilen diamin (OPD) ve alkalin fosfataz ve p-nitrofenil fosfatazdır.

Testi antijenin saptanmasına uyarlamak için katı faz, saptanacak antijene özgü antikorla kaplanır. Daha sonra katı fazın yüzeyindeki herhangi bir antikor-antijen kompleksini tespit etmek için ikinci bir etiketli antikor eklenir. Reaksiyon sırasına bağlı olarak, ELISA’lar doğrudan, dolaylı, yakalama veya rekabetçi testlere ayrılır.

Şekil 20.4, bu testler arasındaki bazı farklılıkları açıklamaktadır. Testler, ikinci antikor olarak anti-insan IgM veya IgG immünoglobulinin kullanılıp kullanılmadığına bağlı olarak IgM veya IgG için spesifiktir. Ayrıntılı bir inceleme için okuyucu, Booth, 1983’e başvurur.

ELISA çok hassas bir tekniktir çünkü az miktarda enzim büyük miktarda substratı işleyebilir. Katı fazda antijen için rekabet eden yüksek seviyelerde spesifik IgG varlığında hatalı negatif IgM sonuçları meydana gelebilir. Bu, numunenin test edilmesinden önce IgG’nin çıkarılmasıyla önlenebilir.

IgM testinde spesifik olmayan reaksiyonlar, romatoid faktör (RF) varlığı nedeniyle de meydana gelebilir. IgM sınıfının RF faktörü, katı fazda antijene bağlandığında spesifik IgG molekülünün Fc bölgesindeki konfigürasyonel değişiklikler nedeniyle maruz kalan yeni antijenlere bağlanır.

Elisa testi
ELISA test
ELISA yöntemi
Serolojik testler
ELISA Çeşitleri
Seroloji testi nerede yapılır
Elisa testi nasıl yapılır
Seroloji Laboratuvarı

IgM RF, virüse özgü IgM’den ayırt edilemez, ancak RF, IgM için test edilmeden önce kümelenmiş IgG ile emilerek uzaklaştırılabilir. Hastanın serumundaki RF veya spesifik IgG’den etkilenmedikleri için IgM yakalama testleri tercih edilir. ELISA’lar objektif olma avantajına sahiptir, kolayca otomatikleştirilebilir ve büyük teknik uzmanlık gerektirmez.

Hızlı testlerdir ve çoğu test 2-3 saat içinde tamamlanabilir. Mikrobiyoloji laboratuvarlarının tümü olmasa da çoğu, HIV, viral hepatit, kızamıkçık, sitomegalovirüs, Epstein Barr virüsü, suçiçeği zoster virüsü, kızamık, kabakulak, toksoplazma, Chlamydia’nın taranması ve serolojik teşhisi için yaygın olarak kullanılan ELISA’ları gerçekleştirmek için donatılmıştır. 

Farklı ELISA Formatları

(a) Dolaylı ELISA:
1. Katı fazı viral antijenle kaplayın.
2. Hastanın serumu ile inkübe edin. Spesifik antikor mevcut
katı faza bağlı antijene bağlanır.
3. Enzim etiketli anti-IgG veya -IgM ekleyin.
4. Substrat ekleyin; reaksiyon pozitifse renk değişimi.
(b) ELISA’yı Yakala:
1. Katı fazı anti-IgG veya IgM ile kaplayın.
2. Hastanın serumu ile inkübe edin. Mevcut tüm IgG veya IgM
katı fazda yakalanır.
3. Antijen ekleyin; bu, yakalanan herhangi bir spesifik antikora bağlanacaktır.
4. Enzim etiketli antiviral IgG ekleyin.
5. Alt tabaka ekleyin; reaksiyon pozitifse renk değişimi. (c) Rekabetçi ELISA:

1. Katı fazı antijenle kaplayın.
2. Hastanın serumunu ve enzim etiketli spesifik antikoru ekleyin. Spesifik antikor, katı faza bağlanmak için konjugat ile rekabet eder.
3. Alt tabaka ekleyin. Pozitif reaksiyon, renksiz olarak gösterilmez.
(a), konjugat spesifik antikor tarafından bloke edildiğinden. Enzim etiketli antikor bloke edilmediğinden negatif reaksiyon (b) ‘de renkle gösterilir.

İmmünofloresan (IF)

Antikor tespiti için indirekt IF’de, viral olarak enfekte olmuş hücreler veya bakteriyel antijen, Teflon kaplı cam slaytlar üzerindeki kuyucuklara sabitlenir, hastanın serumu eklenir ve anti-insan immünoglobülin ile etiketlenmiş antijen-antikor reaksiyonu tespit edilir. (floresein boyası – floresein izotiyonat).

Reaksiyon bir floresan ışık mikroskobu altında okunur, pozitif reaksiyonlar tipik elma yeşili floresan ile gösterilir. Sitomegalovirüs, Epstein – Barr ve varicella zoster virüslerine karşı IgM ve IgG antikorlarının tespiti için Dolaylı IF testleri yıllardır kullanılmaktadır.

IgM sınıfı virüse özgü olmayan antikorun bağlanabileceği, enfekte hücreler üzerindeki reseptörlerin ekspresyonuna bağlı yanlış pozitif reaksiyonlar bir sorundur. IF testleri ayrıca floresan mikroskobu gibi özel ekipman gerektirir ve okumada operatörün önyargısına tabidir. Bu nedenle, antikor tespiti için çoğunlukla ELISA’lar ile değiştirilmişlerdir.

Öte yandan, çeşitli viral antijenlere karşı kaliteli monoklonallerin mevcudiyeti, doğrudan IF’yi çeşitli dokularda ve örneklerde antijenin saptanması için tercih edilen yöntem haline getirmiştir. Enfekte olan materyal, aseton veya alkol yardımıyla bir cam slayta sabitlenir ve test edilen antijene yönelik floresein etiketli monoklonal antikor ile boyanır.

Direct IF, solunum sinsitik virüsü, influenza A ve B virüsleri, parainfluenza 1, 2 ve 3 virüsleri ve adenovirüsler için nazofarengeal aspiratlardan epitel hücrelerinin test edilmesiyle solunum virüslerinin hızlı teşhisi için yaygın olarak kullanılmaktadır.

Radyoimmunoassayler (RIA)

Bunlar ELISA’larla aynı ilkelere sahiptir. RIA testleri, enzim etiketi yerine radyoizotop etiketi kullanır. Radyo-etiketin kısa raf ömrü ve özel radyo-aktivite imha gereksinimleri nedeniyle, bunların yerini ELISA’lar almıştır.

Western blot (WB) veya line immunoassay (LIA)

Bu, mikroorganizmalara karşı antikorları nitroselüloz membranlara yapıştırılmış antijenlere bağlanmaları sayesinde saptamak ve karakterize etmek için oldukça spesifik ve hassas bir araç sağlar.

WB için, yarı saflaştırılmış viral veya bakteriyel proteinler, bir poliakrilamid jel üzerinde elektroforez ile ayrılır ve daha sonra elektroforik olarak bir nitroselüloz membrana aktarılır. LIA’da rekombinant moleküler tekniklerle üretilen veya yapay olarak sentezlenen (sentetik peptidler) viral antijenler doğrudan nitroselüloz membrana eklenir.

The post ELISA Tahlilleri – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

Enterik patojenlerin çoğalmasına izin vermek için bir inkübasyon süresinden sonra, zenginleştirme broth’u, baskılanmış normal flora arasından patojenin izolasyonuna izin vermek için seçici ve diferansiyel agar plakalarına alt kültürlenir.

Sonraki tanımlama prosedürleri, üzerinde çalıştığınız aynı biyokimyasal testlere dayanmaktadır, ancak Salmonella veya Shigella ile yakından ilgili olan enterik türlerin enzimatik aktivitelerini ayırt etmek için daha kapsamlı olabilir.

Diğer bakteriyel patojenler bağırsak hastalığı ile ilişkilidir. Kavisli, gram negatif bir basil olan Campylobacter jejuni, çocuklarda ve genç erişkinlerde ishalin en yaygın bakteriyel ajanı olabilir. Nispeten katı büyüme gereksinimleri vardır ve laboratuvarda izole etmek için özel prosedürler kullanılmalıdır.

Bazı vibriolar, özellikle Vibrio cholerae (kolera ajanı) ve Vibrio parahaemolyticus (Vibrionaceae familyasından), önemli bağırsak yolu patojenlerinin diğer örneklerini temsil eder. Bu organizmalar ayrıca dışkı maddesi kültürlerinden izole edilebilir ve karakteristik morfolojik ve metabolik özellikleriyle tanımlanabilir.

İzolasyon besiyeri seçimi ve tanımlama prosedürleri, bir örnekte aranan organizmanın doğasına göre değişmek zorunda olsa da, ilkeler burada izlediklerimizle aynıdır.

Bakteriyel gıda zehirlenmeleri dahil, sindirim sistemi yoluyla edinilen bulaşıcı hastalıklar hakkında daha fazla bilgi edinmeli ve uygun örneklerin toplanmasından başlayarak, laboratuvar tanılarının temel özelliklerini tartışmaya hazır olmalısınız.

Bu deneyde ve Deney 24.3’te, Salmonella ve Shigella cinsine ait enterik patojenlerin izolasyonu ve tanımlanması için temel yöntemleri gözden geçireceğiz. Genel prosedürlerde gösterilen akış şemasında ve çalıştığınız biyokimyasal reaksiyonlarda özetlenmiştir. Enterobacteriaceae tanımlanması aşağıda incelenmiştir.

Serolojik Nedir
Serolojik tanı Nedir
Serolojik tanı Yöntemleri
Serolojik testler Mikrobiyoloji
Serolojik testler hangileri
Seroloji Laboratuvarı
seroloji-immünoloji
Serolojik test çeşitleri

Amaç
Salmonella ve Shigella türlerinin morfolojisini seçici ve diferansiyel izolasyon plakalarında gözlemlemek;

Malzemeler
EMB veya MacConkey plakaları
Hektoen enterik (HE) plakalar
Bizmut sülfit (BiS) agar plakaları
Salmonella türünün ve Shigella türünün Agar eğik kültürleri

Prosedürler
1. Sağlanan seçici besiyerlerinin her birine bir Salmonella kültürü aşılayın. İzolasyon için seri. Shigella kültürüyle de aynısını yapın.
2. Altı plağınızı 35 ° C’de 24 saat inkübe edin. BiS plakalarının inkübasyonuna 48 saat devam edin.
3. Tüm plakaları inceleyin ve gözlemlerinizi Sonuçlar altına kaydedin.

Enterik Patojenler için Tanımlama Teknikleri

Amaç
Salmonella ve Shigella’nın bazı biyokimyasal reaksiyonlarını incelemek;

Malzemeler

TSI eğimleri
SIM tüpleri
MR-VP besiyerleri
Simmons sitrat eğimleri
Üre suyu tüpleri
Fenilalanin agar slantları
Lizin ve ornitin dekarboksilaz et suları
Damlalıklı şişede mineral yağ
Steril 1,0 ml pipetler
Pipet ampulü veya diğer aspirasyon cihazı
Steril boş tüpler
Ksilen
Kovac reaktifi
Metil kırmızı gösterge
% 5 alfanaftol
% 40 sodyum veya potasyum hidroksit
% 10 demir klorür
Salmonella ve Shigella türlerinin Agar eğik kültürleri

Prosedürler

1.Salmonella veya Shigella için bir kültür atayacaksınız. Sağlanan her bir ortamın inoküleonetübünü (yani: TSI ;SIM; MR-VP besiyeri; eğik sitrat; üre, lizin ve ornitin besiyerleri; ve fenilalanin agar) deneyin.
2. Tüm tüpleri 35 ° C’de 24 saat inkübe edin.
3. IMViC ve PD testlerini tamamlayın. Sonuçlar altındaki tüm biyokimyasal reaksiyonları okuyun ve kaydedin. Komşularınızın sonuçlarını gözlemleyin ve her iki organizma için tüm bilgileri kaydedin.

Enterik Organizmaların Serolojik Tanımlaması

Kültür tanımlama tekniklerine ek olarak, gram-negatif enerji basilinin (genellikle Salmonella ve Shigella türleri ve Escherichia coli) O ve H antijenlerini saptamak için antikor reaktifleri mevcuttur. Antikorlar, kültürde izole edilen bilinmeyen bir organizmanın antikor reaktifi (antiserum) ile karıştırıldığı basit bir bakteriyel aglütinasyon testinde kullanılır.

Antikorlar, organizmanın antijenik yapısı için spesifik ise, bakterilerin aglütinasyonu (kümelenmesi) meydana gelir. Antiserum belirli antikorlar içermiyorsa topaklanma görülmez. Antiserum yerine salinin ikame edildiği bir kontrol testi, organizmanın antikorların yokluğunda kümelenmediğinden emin olmak için her zaman dahil edilmelidir.

Bu alıştırmada, bir mikroorganizmanın yüzey antijenlerinin bakteriyel hücrelerin görünür bir şekilde aglütinasyonunu oluşturan bilinen bir antikorla etkileşimi ile nasıl tanımlanabileceğini göreceksiniz.

Amaç
Bir mikroorganizmanın slayt aglütinasyon tekniği ile tanımlanmasını göstermek için

Malzemeler
Cam slaytlar
% 70 alkol
Salin (% 0.85)
Kılcal pipetler
E. coli veya Salmonella E. coli veya Salmonella antiserum’un ısı ile öldürülmüş süspansiyonu

Prosedürler

1. Slaytı% 70 alkolle dikkatlice yıkayın ve kurumaya bırakın.
2. Bir cam işaretleme kalemi veya kurşun kalem kullanarak slaydın zıt uçlarında iki daire çizin.
3. Kapillaripipeti kullanarak, kontrol içinadropofsalin bir daire. Markthiscircle “C” yerleştirin.
4. Yeni bir kapiler pipetle diğer daireye bir damla antiserum koyun.
5. Her dairedeki malzemeye bir damla ısıyla öldürülmüş bakteri süspansiyonu (bu antijendir) eklemek için başka bir pipet kullanın.
6. Sürgüyü başparmağınız ve işaret parmağınızla kenarlarından kaldırın ve birkaç saniye ileri geri sallayın.
7. Slaydı iyi bir ışık üzerinde tutun ve iki daire içindeki süspansiyonun görünümündeki herhangi bir değişikliği yakından izleyin.

Sonuçlar

1. Aşağıdaki diyagramda, slaydın her iki ucundaki süspansiyonlarda gözlemlediğiniz gözle görülür farklılıkları belirtin.
2. Sonuç hakkındaki yorumunuzu belirtin.

Fermentatif Olmayan Gram-Negatif Basilleri Enterobacteriaceae’den

Ayırt Etme Teknikleri

Normalde toprakta ve suda yaşayan veya insan mukoza zarında bulunan çeşitli gram-negatif basiller, kültür için mikrobiyoloji laboratuvarına gönderilen örnekleri kontamine edebilir veya daha da önemlisi fırsatçı insan enfeksiyonları üretebilir.

Organizmaların Gram boyama görünümü ve kültürel özellikleri Enterobacteriaceae’ninkilere benzeyebilse de, yaygın biyokimyasal testlerde nispeten etkisizdirler. Özellikle, glikozu metabolize edemezler veya onu fermentatif yollardan ziyade oksidatif yollarla bozarlar.

Bu nedenle bu organizmalara sıklıkla “glukoz fermente etmeyenler” (glukoz fermente eden enterik basillerin aksine) adı verilir. Bu fermente etmeyenler grubuna bir dizi bakteri cinsi ve türü dahildir.

Tıbbi açıdan en önemlisi, çoğunlukla insan enfeksiyonunda rol oynayan Pseudomonas aeruginosa’dır. Farklı klinik çıkarımlar ve değişken antimikrobiyal duyarlılık modelleri nedeniyle (fermente etmeyenler yaygın antimikrobiyal ajanlara daha yüksek dirençlidir), fermente etmeyenleri enterik basilden ayırmak önemlidir.

Birkaç fermente olmayan bakterinin özellikleri listelenmiştir ve Enterobacteriaceae’ninkilerle karşılaştırılmıştır.

The post Serolojik Tanımlama – Laboratuvar Ödevleri –Tez danışmanlığı – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Elektrik Mühendisliği Ödev Yaptırma – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).