Genetik mühendisliğindeki son gelişmeler, saflaştırmayı kolaylaştırmak için proteinlerin yapısını değiştirme olasılığını yaratmıştır. Spesifik bir proteini kodlayan genlerin manipüle edilmesiyle, füzyon peptidleri, saflaştırılmalarına yardımcı olan N ve C terminallerine eklenebilir.

Peptit uzantıları daha sonra çıkarılır ve protein, geleneksel saflaştırma yöntemleriyle geri kazanılır (Shine ve diğerleri, 1980). Belirli bir yöntem, bir dizi arginin kalıntısının eklenmesiyle izoelektrik noktayı büyük ölçüde değiştirmek için proteinin C-terminalini kullanır.

Ligandları N-terminaline bağlayan diğer birçok “saflaştırma füzyonunun” aksine, bu, proteinin doğru şekilde katlanmasına izin verir. Katyon değişim kromatografisi ile ilk saflaştırmadan sonra, arginin kalıntıları bir ekzopeptidaz (karboksipeptidaz B) ile uzaklaştırılabilir, böylece ilgilenilen proteinin pl’si değiştirilir ve daha sonra ikinci bir katyon değişim aşaması çıkarılır.

Protein, bu ikinci aşamada farklı bir pozisyonda ayrıştırılırken, kirleticiler değişmeden kalacaktır (C-terminalinde bir dizi arginin kalıntısına sahip olmadıkları sürece).

Bu metodoloji, proteinleri önceden planlanmış saflaştırma prosedürlerine uyacak şekilde tasarlama heyecanını sunar. Belki gelecekte tüm proteinler için tek bir işlem kullanmak mümkün olabilir (birincil dizinin önceden bilinmesi şartıyla).

Aşağıdaki bölümler, HPLC’nin proteinlerin, peptitlerin ve amino asitlerin izolasyonunda ve analizinde kullanılan çeşitli yöntemlere uygulanmasını tartışmaktadır. Gözetimsiz gradyan geliştirmeye izin veren enstrümantasyonla birleştirilmiş yeni sabit fazların geliştirilmesi, saflaştırma görevini dönüştürmüştür. Bu yönlerden bazıları da bu bölümde tartışılacaktır.

 İyon Değiştirici Kromatografi

İyon değişim kromatografisi (IEC), proteinlerin ayrılması için en yaygın kullanılan moddur, çünkü optimum kromatografik koşullar, karmaşık biyopolimerlerin ikincil ve üçüncül yapısının korunması ile uyumludur.

IEC’de bir çözünen maddenin tutulması iyonik kuvvet, pH ve sıcaklık değiştirilerek kontrol edilebilir. Ek olarak, bu parametrelerin iyileşmeyi de etkileyebileceği gözlemlenmiştir.

Bununla birlikte, mobil faz seçimi çoğu protein için ampiriktir ve bir saatten daha kısa çalışma süreleri (yeniden dengeleme dahil) kullanarak kromatografik koşullar geliştirme yeteneği bu nedenle oldukça faydalıdır. Silika veya organik polimere dayalı yüksek performanslı anyon ve katyon değiştiriciler artık yaygın olarak kullanılmaktadır ve önceki sabit faz türlerinde bulunmayan bir kararlılık derecesine sahiptirler.

IEC proteinleri için kullanılan sabit fazlar, büyük bir gözenek boyutuna (30-50 nm) sahip olan küresel boncuklardan oluşur. Büyük gözenek boyutu mekanik mukavemeti azaltır ve bu nedenle daha düşük çalışma basınçları gerekir (tipik olarak 1 ml / dakikada 500 psi’den büyük değildir).

IEC proteinleri için en popüler ve başarılı sabit faz türleri, Toyo Soda’dan polimer bazlı TSK-PW, Pharmacia’dan FPLC Mono Beads ve Synchrom Inc.’den silika bazlı Synchrom boncuklarıdır.

Polimer bazlı sabit fazlar, yüksek pH değerlerinde (> pH 8.0) silika ile ilişkili çözünme problemlerinden muzdarip olmadıklarından daha geniş bir pH aralığında (pH 2.0-pH 10.0) kullanılabilir.

Bu durağan aşamalar bu nedenle daha popülerdir. Yeni TSK-5PW-SP sabit fazdaki (500 ml yatak hacmi) hazırlayıcı ayırmalar, analitik boyutlu bir kolon üzerinde elde edilenlerle karşılaştırılabilir sonuçlar vermiştir (Brewer ve diğerleri, 1986), böylece gram miktarlarının hazırlanması için ölçek büyütmeye izin verir.

Katyon değişimi kullanılarak doku kültüründen insan gama interferonunun saflaştırılmasında bir ara aşama  gösterilmektedir. 10 mM sodyum fosfat, pH 7.0 içinde dengelenmiş bir Mono-S sabit faz, dengeleme tamponunda% 20 etilen glikol ile kullanıldı. Elüsyon, gösterildiği gibi doğrusal bir tuz konsantrasyonu ile gerçekleştirildi.

Jel filtrasyon kromatografisi nedir
Afinite kromatografisi nedir
Adsorpsiyon kromatografisi Nedir
Afinite kromatografisi çalışma prensibi
Kolon kromatografisi nedir
İyon değişim kromatografisi nedir
İyon exchange kromatografisi
İyon kromatografisi nedir

Ters Faz Kromatografisi

Büyük proteinlerin (> 30 kDa) kromatografisi için geniş gözenekli yüksek performanslı ters faz desteklerinin getirilmesi, bu sabit fazların her boyuttaki proteinler için kullanılmasını teşvik etmiştir.

Teoride, geniş gözenekli sabit fazlar, yalnızca moleküller daha küçük gözeneklere girmekten dışlanacak kadar büyük olduğunda gereklidir. Genel olarak, daha küçük gözenek boyutlu sabit fazların kullanılması yararlıdır çünkü bunlar, bağlanma için mevcut yüzey alanındaki artıştan dolayı daha büyük bir verime sahiptirler.

Böylece, küçük bir protein için, daha küçük gözenek boyutlu sabit fazda daha yüksek bir plaka numarası (N) elde edilecektir. Birçok biyolojik olarak aktif protein, organik çözücüler tarafından veya ters fazın normal olarak çalıştığı düşük pH ile denatüre edilebilmesine rağmen, diğer proteinlerin, mobil fazın çıkarılması üzerine yeniden katlanma yeteneklerinden dolayı oldukça stabil olduğu bulunmuştur.

Belirli durumlarda, özellikle protein sekans analizi için saflaştırılıyorsa, biyolojik aktivitenin sürdürülmesi gerekli olmayabilir.

Ters fazlı bir protein ayırma örneği,  gösterilmektedir, burada Tip I ve I11 kolajenin (300 kDa) olgun formlarının, geniş gözenekli bir deri üzerinde 30 dakikadan daha kısa bir sürede tamamıyla ayrılması sağlanmıştır. Asetonitrilin trifloroasetikasidin bir aşamalı gradyanı kullanılarak Cı sabit faz. Kromatografiden 30 dakika önce 56 ° C’de denatürasyon, ayrı alt birim zincirlerinin çözülmesine izin verdi.

In vivo alt nanomol miktarlarında bulunmalarına rağmen ters faz kromatografisi kullanılarak başarıyla izole edilmiş proteinlerin uzun bir listesi vardır. Bunlar, kolajen, kan proteinleri, enzimler, hormonlar, glikoproteinler gibi yapısal proteinleri ve insan büyüme hormonu ve epidermal büyüme faktörü gibi farmasötik açıdan ilginç proteinleri içerir.

Ek olarak, proteinlerdeki konformasyonel değişiklikleri incelemek, protein hidrolizatlarında sistein içeren peptitleri tanımlamak ve küçük ve büyük moleküller arasındaki kromatografik davranış farklılıklarını incelemek için ters faz kromatografisi kullanılmıştır.

Ters fazlı kromatografide proteinlerin tutulma mekanizması açıkça tanımlanmamıştır, ancak çözünürlük kaybı olmadan daha kısa kolonlar kullanma yeteneği, işlemin tek başına basit bölme kromatografisi ile kontrol edilmediğini göstermektedir.

Bu nedenle, kolon verimliliğini değerlendirirken, basit organik moleküller yerine bir dizi hidrofobikliğe sahip bir protein karışımından oluşan bir standardın kullanılması önemlidir. Ek olarak, bu, kısa kolonlu sistemlerin, maliyette önemli bir tasarruf sağlayacakları için protein ayırmaları için en uygun olabileceği anlamına gelir.

The post  İyon Değiştirici Kromatografi – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

Mod, sabit fazdaki gözeneklerin farklı moleküler boyutlara sahip moleküllere erişilebilirliğine dayanır ve proteinler, karbonhidratlar ve lipidler gibi yüksek molekül ağırlıklı biyolojik örnekler için özel bir uygulamaya sahiptir. Daha küçük bileşenler gözeneklere daha fazla nüfuz edebilir ve bu nedenle gözeneklerden hariç tutulan daha büyük moleküllere göre kolon üzerinde daha uzun süre tutulur.

Adsorpsiyon Kromatografisi

Bu modda, silika (veya bazen alümina) genellikle sabit faz olarak kullanılır, ancak bu yöntem biyolojik numuneler için yaygın olarak kullanılmaz ve genellikle bağlı normal faz sabit fazlarla değiştirilir. Yöntem, mobil faz ve sabit faz için numunenin farklı afinitelerine dayanır.

 Bölme Kromatografisi

Tüm uygulamaların% 90’a kadarı, iki karışmayan sıvı faz arasında çözünen maddelerin bölünmesine dayanan bu kromatografi modunu kullanır; biri sağlam bir desteğe, diğeri mobil. En popüler sabit faz, oktadesilsilan (OD’ler veya C ,,) kaplı silika partikülüdür, ancak daha düşük homologlar (Cı, C,) de kullanılır.

Ters faz kromatografisinin popülaritesi, zincir uzunluğu, zincir tipi ve karbon yüklemesi bakımından değişen çok sayıda ticari ambalajın mevcudiyeti ile artmaktadır. Bu nedenle, kromatograf sadece hareketli faz bileşimini değiştirerek değişen seçicilik seçimine sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda farklı bir sabit fazı da seçer.

Kromatografiyi fazlamak mümkündür. İyonik yükler, tersine çevrilmiş pH kullanılarak hem iyonize edilmiş hem de iyonize edilmemiş ayrı çözünen maddelerin manipülasyonu veya bir iyon çifti reaktifinin dahil edilmesiyle bastırılabilir.

Daha polar bileşenler için, bağlı normal faz destekleri özellikle yararlıdır ve çözücü bileşimi değişikliklerine hızlı bir tepkiye izin vererek silika üzerinde adsorpsiyon kromatografisine göre faydalara sahiptir.

Ligand değişimi ve afinite kromatografisi gibi diğer bölme kromatografisi modları, suda çözünür biyomoleküllerin çözülmesi için özel uygulamalar bulmuştur.

Afinite kromatografisi
Jel Filtrasyon kromatografisi
İyon değişim kromatografisi
İyon exchange kromatografisi
Adsorpsiyon kromatografisi
Afinite kromatografisi çalışma prensibi
Hidrofobik etkileşim kromatografisi
İyon Kromatografisi

İyon Değişim Kromatografisi

İyon değişim kromatografisinde tutulma, çözünen maddenin karşıt yüklü grupları ile sabit faz arasındaki elektrostatik etkileşimler tarafından yönetilir. Seçicilik, mobil fazın doğasından veya sıcaklıktan etkilenebilir.

Özellikle çok bileşenli örnekler için belirli uygulamalar, bileşenleri yeterince ayırmak için birden fazla HPLC modu gerektirir ve bu, çok boyutlu HPLC kullanılarak sağlanabilir.

 Çözücü Seçimi

Bu bölüm, ilk ilkelerden mobil faz seçimine rehberlik etmek için tasarlanmıştır. Mobil faz bileşiminin seçimi, elde edilebilen büyük ölçüde farklı seçicilikler nedeniyle kritiktir. Bazı durumlarda, son seçimi, kullanılabilirlik ve gider gibi önemsiz faktörler belirleyebilir.

Uygun bir mobil fazın seçimi için esasen üç kriter vardır. Bunlar numunenin fizikokimyasal özelliklerine, çözücülerin fizikokimyasal özelliklerine ve örneğin TLC ile hareketliliğine (mümkünse) dayanmaktadır.

Numunenin Fizikokimyasal Özellikleri

Numune kolona ayırma için kullanılandan farklı bir çözücü içinde uygulanırsa olağandışı kromatografik etkiler gözlemlenebilir.

Örneğin, numune daha güçlü bir çözücü içinde çözülürse, o zaman sütun dengesinin bozulduğu bir bant, sütunda aşağı doğru ilerler ve çoğu zaman çözünürlüğü bozar. Bu nedenle, genel bir kural olarak, numunenin çözünür olduğu bir mobil faz seçmek ve çözünürlük sınırlayıcı bir faktör ise daha büyük bir enjeksiyon hacmi kullanmak her zaman en iyisidir.

Çözücülerin Fizikokimyasal Özellikleri

Çeşitli çözücülerin genel fizikokimyasal özelliklerini göstermektedir. Teoride, bu çözücülerden herhangi biri kromatografi için kullanılabilir, ancak pratik amaçlar için bir dizi çözücü genellikle çeşitli nedenlerle ortadan kaldırılabilir:

(a) yüksek viskoziteye sahip çözücüler, kromatografik kolondaki akış sırasında daha yüksek geri basınçlara neden olur,
(b) düşük kaynama noktalarına sahip çözücülerin hareketli fazda sabit bir konsantrasyonda tutulması zor olabilir ve ayrıca yangın tehlikesi oluşturabilir,
(c) yüksek UV kesme dalga boyuna sahip çözücüler, yaygın olarak kullanılan dalga boyu aralıklarında UV tespitini engeller,
(d) bazı çözücüler toksiktir (örneğin benzen) ve
(e) bazı çözücülerin saflığı partiden partiye değişebilir.

Bu nedenle, yalnızca sınırlı sayıda çözücü genel kullanıma sahiptir. Asetik asit ve trietilamin, bazen iyon değişim kromatografisinde kullanılan sulu tamponların hazırlanmasında kullanıldıkları için dahil edilmiştir.

Son olarak, esas olarak tutulmayı kontrol eden çözücü mukavemeti olsa da, protik çözücülerdeki hidrojen bağının da tutmayı etkileyebileceğine dikkat edilmelidir.

 Numunenin TLC’ye Göre Hareketliliği

Çoğunlukla tek bir çözücü, optimum kromatografik çözülmeye izin vermez ve ayırmaların çoğu, mobil faz olarak çözücülerin bir karışımını kullanır. Optimum mobil faz seçimi genellikle deneme yanılma yoluyla belirlenebilir, ancak TLC kullanılarak bazı kılavuz bilgiler de elde edilebilir.

Teorik olarak, bir TLC plakasındaki mobilite, k ‘= (1 – Rf) / Rf olduğundan, HPLC tutulmasıyla doğrudan ilişkilidir, ancak, TLC dengesiz bir işlem olduğundan ve genellikle daha düşük çözücü kuvvetleri gerektiğinden pratikte farklılıklar vardır. eşdeğer bir HPLC ayırması için. Bununla birlikte, TLC hareketliliği, birçok çözücü karışımını karşılaştırmak için hızlı bir yöntem de sağlar.

Genel olarak, bir numune karışımının ayrıştırılmasının geliştirilmesinde, numune başlangıçta düşük elüsyon kuvvetine sahip bir çözücü içinde HPLC kolonuna enjekte edilir ve daha sonra ilgili bileşikler kolondan ayrılıncaya kadar sürekli olarak da arttırılır.

Bu yöntemin temel sınırlaması, elüsyonun gerçekleştirilmesinin uzun zaman alabilmesi ve sonuç olarak, bu prosedürü, eluent kuvvetinde farklı sıçramalar ile tersine kullanmanın genellikle daha hızlı olmasıdır. Modern ekipman, gradyan geliştirmenin gözetimsiz yürütülmesine izin verir.

Birçok üretici, korozyon olasılığı nedeniyle paslanmaz çelik pompalarda düşük pH değerinde halojenür iyonlarının kullanımından kaçınılmasını önermektedir. Bu nedenle, halojenür iyonlarının kullanıldığı yerlerde, kullanılmadığında sistemden su ile yıkanmaları da tavsiye edilir.

Halide iyonları kullanılırken, pompanın haftada en az bir kez 20 dakika süreyle sistemden (kolondan değil!)% 20 nitrik asit solüsyonu pompalanarak da geçirilmesi tavsiye edilir.

The post İyon Değişim Kromatografisi – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).