Prensipler

TLC, 1960’larda kağıt kromatografisinin yerini aldı ve şimdi kendisinin yerini büyük ölçüde HPLC alıyor. TLC’de sabit faz (genellikle alümina, silika jel veya selüloz) bir cam, plastik veya metal plaka üzerine kaplanır. Plakanın bir ucuna uygulanan bir çözücü karışımı (hareketli faz), kılcal çekim ile plaka boyunca hareket eder ve plakaya uygulanan bir numunede çözünen maddelerin kromatografik olarak ayrılmasına neden olur.

Floresan olmadıkça, çoğu bileşik, görselleştirilmelerini sağlamak için türevlendirmeye (kimyasal modifikasyon) ihtiyaç duyacaktır: bu, tipik olarak, kromojenik reaktifler ile püskürtme veya plakaya daldırma yoluyla elde edilir.

Kalitatif bilgi, plakayı görüntüleyerek basitçe elde edilebilir ve tek tek noktaların tanımlanması, tutma faktörünün ölçülmesiyle elde edilebilir (Rf, noktanın kat ettiği mesafe, çözücü cephesi tarafından kat edilen toplam mesafeye bölünür).

Plaka ikinci kez çalıştırılarak daha yüksek çözünürlük elde edilebilir, ancak çözücü yönü ilk çalıştırmada 90’a eşittir (iki boyutlu TLC). 2-D TLC’nin dezavantajı, her plakaya sadece bir numunenin uygulanabilmesidir.

Kantitasyon, ya plakayı tarayabilen bir yoğunluk ölçer kullanımını ya da noktanın durağan fazdan elüsyonunu ve ardından kolorimetrik ölçümü gerektirir. Ancak 2-D TLC, proteomik alanındaki gelişmelerle birlikte yeniden ilgi görmüştür.

2-D TLC’yi takiben, tek tek proteinlere karşılık gelen noktaların modeli, belirli bir hastalığı olan bireyler ve kontroller arasında karşılaştırılır ve ilgili spesifik proteini tanımlamak için gruplar arasında yoğunlukta farklılık gösteren noktalar plakadan ayrıştırılır.

Uygulamalar

TLC, diğer kromatografik yöntemlere kıyasla nispeten hızlı, ucuz ve kolay olduğu için günümüzde ağırlıklı olarak bir tarama tekniği olarak kullanılmaktadır. Bir klinik laboratuvarda TLC uygulamaları, amino asitlerin, ilaçların ve karbonhidratların tahlillerini içerir.

Amino Asitler

Fenilketonürili çocukların erken tespiti için birçok ülkede yenidoğan tarama programları mevcuttur. Fenilalanin için spesifik spektrofotometrik veya HPLC yöntemleri mevcut olmasına rağmen, birçok tarama laboratuvarı, diğer amino asit bozukluklarının, örn. tirozinemi, akçaağaç şurubu idrar hastalığı vb.

Anormal şekilde yükseltilmiş bir amino asidin kimliğinin teyidi daha sonra 2-D TLC veya HPLC, örn. Akçaağaç şurubu idrar hastalığında anormal şekilde yükselmiş dallı zincirli amino asitlerin (lösin, izolösin ve valin) karakteristik modelidir.

Özellikle kütle spektrometrisi (LC–MS; daha sonra bakınız) ile kombinasyon halinde sıvı kromatografisi ile bağlantılı teknolojideki son gelişmeler, yenidoğan tarama programlarında TLC kullanımında bir azalmaya yol açmıştır.

İnce tabaka kromatografisi
TLC kromatografi
İnce tabaka kromatografisi SORULARI
Kağıt kromatografisi ve ince tabaka kromatografisi arasındaki farklar
Kolon ve ince tabaka kromatografisi
Kolon kromatografisi
İnce tabaka kromatografisi Deneyi
Adsorpsiyon kromatografisi

İlaçlar

İdrar ilaç taraması, bazik, nötr ve asidik bileşikleri içeren, ‘eğlence amaçlı’ kullanım için mevcut olan veya kasıtlı veya kazara aşırı dozda alınan ilaçların çeşitliliği nedeniyle karmaşıktır. Bilinci kapalı veya koopere olmayan hastada, spesifik ilaçların tüketimi hakkında çok az bilgi bulunabilir.

TLC genellikle ilk tarama ve ticari sistemler için tercih edilen tekniktir, örn. Toxilab1, mevcuttur. Bunlar, sistemlerden herhangi birine dahil edilen nötr ilaçlarla asidik ve bazik ilaçlar için ayrı plakalara ve solvent sistemlerine sahip olma eğilimindedir.

Farklı kromojenik reaktiflerin ardışık olarak püskürtülmesi, farklı ilaçların farklı renklerle boyanmasına neden olur ve böylece daha kolay tanımlamaya izin verir. Ancak son yıllarda, kötüye kullanılan ilaçların birinci basamak taraması için otomatik analizörlerde enzim immünolojik testlerinin kullanımına yönelik önemli bir hareket olmuştur.

Karbonhidratlar

TLC, karbonhidrat metabolizması bozuklukları, örn. fruktozüri, vb. Bu uygulama için sadece kalitatif sonuçlar gereklidir, ancak ağızdan tatbik edilen şekerler kullanılarak gastrointestinal sistem fonksiyonu ve bütünlüğü için testlerin geliştirilmesi, şekerlerin kantitatif TLC’sine ihtiyaç duyulmasına neden olmuştur.

Bir örnek, mide-bağırsak yolunun duvarını farklı mekanizmalar yoluyla geçen mono- ve disakkaritlerin (ksiloz, ramnoz, 3-0-metilglikoz ve laktuloz) kullanılmasıdır. Gastrointestinal sistem hastalıklarının ayırıcı tanısıdır.

Emilim için uygun olan bağırsak yüzeyindeki azalma (örneğin çölyak hastalığı) monosakkarit emiliminde ilerleyici bir azalmaya yol açarken, bağırsak duvarının bütünlüğünün zarar görmesi (örneğin Crohn hastalığında) disakkarit emiliminde bir artışa yol açar.

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC)

Prensipler

HPLC, klinik laboratuvarda kullanılan en yaygın kromatografi şeklidir. Gelişmiş performans, katı fazı dar sütunlarda (tipik olarak 150 5 mm) içererek ve hareketli fazı basınç altında (tipik olarak 1.5-2.0 atmosfer basıncı) kolondan pompalayarak elde edilir.

HPLC’de zaman zaman iyon değişimi veya boyut dışlama ayırma mekanizmaları kullanılsa da, çoğu yöntem moleküllerin katı faza adsorpsiyonuna dayanır. Normal fazlı HPLC’de, bir silika paketleme malzemesinin yüzeyindeki hidrofilik bağlanma grupları hidrofilik molekülleri çeker ancak hidrofobik molekülleri çekmez, ters fazlı HPLC için bunun tersi doğrudur.

Bu nedenle, normal faz HPLC’de artan polariteye sahip bir mobil faz, polar molekülleri katı fazdan daha etkin bir şekilde uzaklaştırırken, ters fazlı HPLC’de giderek artan hidrofobik (organik) mobil fazlar, polar olmayan molekülleri katı fazdan daha kolay uzaklaştırır. Bu nedenle, ters fazlı HPLC, biyolojik sıvılarda baskın olan yüksüz moleküllerin ayrılması için özellikle uygundur.

HPLC için ekipman

Bir HPLC sisteminin bileşenleri şunları içerir: bir pompa(lar), numune yerleştirme sistemi (şırınga enjektörü veya otomatik numune alıcı), kolon, dedektör ve veri toplama sistemi (tablo kaydedici veya bilgisayar). Çoğu uygulama için, sabit bir akış hızında (tipik olarak 1-2 ml/dak), yani izokratik elüsyonda tek bir sıvı faz kullanılabilir.

Bununla birlikte, ayrılmakta olan bileşiklerin yapı olarak benzer olduğu bazı karmaşık uygulamalarda, analiz sırasında sıvı fazın bileşiminin değiştirilmesi, yani gradyan elüsyonu gerekli olabilir. Gradyan elüsyonunun bir örneği, kan veya idrardaki amino asitlerin ayrılmasıdır.

HPLC için saptama yönteminin seçimi, rutin olarak kullanılan ultraviyole (UV), floresan ve elektrokimyasal (EC) saptama ile analitin türüne bağlıdır. UV tespiti, ters fazlı HPLC’de baskındır, ancak mobil fazdaki yüksek organik çözücü konsantrasyonu 190 ile 230 nm arasında büyük bir arka plan absorpsiyonu ile sonuçlandığından, normal faz yöntemlerinde nadiren kullanılır.

The post İnce Tabaka Kromatografisi – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

Paketlenmiş kapiler (PC) kolonlar, orijinal olarak Novotny ve arkadaşları tarafından geliştirilmiştir ve paketlenmiş mikro delikli kolonlar ile OTC kolonları arasında bir hibrit olarak kabul edilebilir. PC kolonları, OTC kolonlarından daha büyük bir iç çapa sahiptir ve kolon duvarına fiilen gömülü bir dizi partikül ile kolon içinde eşit olarak dağıtılmış bir paketleme malzemesi içerir.

Kolonlar, alümina veya silika jelin (10-100 um çapındaki partiküller) daha sonra bir kılcal damar içine çekilen kalın duvarlı bir cam kolona doldurulmasıyla oluşturulur. Bu sütunlar, OTC sütunlarına kıyasla daha yüksek stabilite gösterir ve 100.000 bölgesindeki sütun plakası sayıları rapor edilmiştir, bu da karmaşık örneklerin çözümlenmesi için potansiyellerini gösterir.

Genel Değerlendirmeler

Yukarıdakiler, mikro kolonların geleneksel benzerlerine göre belirli avantajlarını önermektedir, ancak tartışılmayan bir yön, mikro kolonların yüksek hızlı kromatografide sahip olabileceği avantajlardır.

Mikro kolonların yalnızca küçük bir iç çapa sahip olması nedeniyle, nispeten düşük akış hızları, mikro kolonların yüksek verimliliği ile birlikte çok hızlı ayırmalar sağlayabilen yüksek doğrusal bir mobil faz hızı üretir.

Ne yazık ki, bu tür hızlı ayırmalarla, dedektörde çok düşük bir akış hücresi hacmi gerekliliğine ek olarak, ekipmanın yanıt süresi de çoğu geleneksel dedektörde bulunandan daha az olmalıdır.

Bununla birlikte, normal çalışma koşulları altında mikro kolonlar, çok düşük akış hızlarıyla çok verimli ayırmalara izin verir ve kılcal kolonlar kullanılarak yapılan bir ayırma hızının, teorik plakaların sayısı 20.000’i aştığında geleneksel HPLC kolonlarının hızını aşacağı gösterilmiştir.

Mikro sütunlar böylece solvent tüketiminde% 90-99 arasında azalma ve buna eşlik eden ekonomik ve çevresel avantajlar sağlayabilir. Mikro kolonların ek bir avantajı, pik hacminin çok azalmasından kaynaklanan yüksek kütle hassasiyeti potansiyelleridir, böylece pikteki ortalama nispi çözünen konsantrasyonu büyük ölçüde artar ve böylece tespitin potansiyel hassasiyetinin artmasına izin verir.

Sonuç olarak, mikro kolon HPLC ile elde edilebilen daha yüksek kolon verimleri, karmaşık biyolojik numunelerin analizi için mutlak bir gereklilik olabilir. Önümüzdeki birkaç yıldaki teknik gelişmeler, muhtemelen ticari olarak temin edilebilen ilk mikrokolon HPLC sisteminin tanıtımına izin verecektir.

Kolon kromatografisi Deneyi
Kolon kromatografisi dolgu maddeleri
Kromatografi yöntemleri
Kromatografi Türleri
Kolon kromatografisi nasıl yapılır
İnce tabaka kromatografisi deneyi
Hareketli faz nedir
Kromatografi Sınıflandırılması

Sütun Ambalajları

Sıklıkla iyi bir HPLC sisteminin kalbinin kolon olduğu söylenir ve açıkça, sistemin geri kalanının mükemmelliğine bakılmaksızın, kolon verimsiz ise, iyi bir ayırma elde edilemeyecektir. Bu bölümde, partikül boyutu ve şekli ve kolon gözenekliliği dahil olmak üzere kolon paketlemesinin etkisi ele alınmaktadır.

Parçacık Boyutu

Son on yılda, daha kısa sürede daha fazla çözünürlüğe izin vermek için kromatografik ayırmaların verimliliğini artırmaya yönelik çok fazla çaba harcanmıştır. Bir kromatografik ayırmanın özü, ayrıştırılmış tepe noktalarının bant genişlemesini azaltmaktır.

Bant genişlemesinin beş ana nedeni şunlardır: (a) durgun mobil faz kütle transferi, (b) girdap difüzyonu, (c) uzunlamasına difüzyon, (d) durağan faz kütle transferi ve (e) mobil faz kütle transferi.

Bu parametrelerden, durgun mobil faz kütle transferi, partikül boyutundaki varyasyonla manipülasyon için en erişilebilir olanıdır. İlk ambalajlar, tamamen gözenekli olan ve durgun hareketli fazın erişilemeyen derin havuzlarının oluşumuyla sonuçlanan büyük silika parçacıklarından (30 pm çap ve üzeri) oluşuyordu.

Bu problem büyük ölçüde, katı bir çekirdek (genellikle cam) ve ince (1-2 um) gözenekli bir sabit faz dış tabakasından oluşan ince tabakalı paketlerin geliştirilmesiyle aşılmıştır. Bu pelliküler paketler bu nedenle yüzeysel olarak gözenekliydi ve sadece sığ bir durgun mobil faz havuzuna sahipti.

Bununla birlikte, pellicular kolonların en büyük dezavantajı, parçacıkları kaplayan nispeten küçük miktarda sabit faz nedeniyle düşük numune yükleme kapasitesiydi. Açıkça, karmaşık bir karışımdaki bir bileşiğin tespit limitleri, sadece nispeten küçük bir miktar numune yüklenebildiğinden, önemli ölçüde azaltıldı.

Daha yakın zamanlarda, durgun mobil fazda kütle transferi sorunlarını fiilen ortadan kaldıran tamamen gözenekli mikro partikül paketleri (3-10 um partikül çapı) geliştirildi ve artık pellicular ambalajlar, erken yöntem geliştirme haricinde nadiren kullanılmaktadır.

Şu anda analizlerin çoğu, son zamanlarda ikincisine doğru bir eğilime sahip olan 10 pm veya 5 pm partiküllerle paketlenmiş kolonlar üzerinde gerçekleştirilmektedir. Teorik olarak, partikül boyutundaki bir azalma, kolon plaka yüksekliklerini büyük ölçüde azaltacak ve kolon çözme gücünü artıracaktır ve yaklaşık 2 pm’lik bir partikül çapının birçok ayırma için optimum olacağı tahmin edilmiştir.

Son zamanlarda, 3 pm parçacıklı kolonlar ticari olarak temin edilebilir hale gelmiştir ve bunlar, sütun metre başına plaka sayısı açısından artan performans göstermekte ve artan ayırma hızları sağlamaktadır.

Bununla birlikte, 15 cm uzunluğunda, 5 pm partikül boyutlu ters faz kolonunun 7,5 cm uzunluğunda, 3 pm partikül boyutlu kolon ile karşılaştırılması, mobil faz akış oranının artırılmasıyla, 5 pm partikül ile eşdeğer çözünürlük sürelerinin elde edilebileceği sonucuna varmıştır.

3 pm parçacık boyutu sütununa eşdeğer etkinliğe sahip boyut sütunu, ancak sütun boyunca basınç düşüşü 5 pm parçacık boyutu sütununda daha büyük olmuştur.

Bu durumda çözünürlük süresindeki kazanç, plaka numarası pahasına elde edildi, 5 pm partikül boyutu kolonunun optimal koşullar altında daha büyük bir plaka numarasına sahip olmasıyla. Bu nedenle, bir 5 pm parçacık boyutu sütununun ekstra verimliliği gerekmedikçe, 3 pm parçacık boyutu sütunu, mobil fazların tüketiminde sonuç olarak bir azalma ile daha kısa çözünürlük süresi sağlayabilir.

Parçacık boyutunun 5 pm çapın altına düşürülmesi dört ana sorun ortaya çıkarmaktadır: (a) tepe noktalarının kolondan ayrıldığı çok küçük hacim, (b) hareketli fazın viskoz ısınması ve bunun sonucunda kolon içinde termal gradyanların oluşması , (c) numune yüklemesinde azalma ve (d) kolonların katılar tarafından tıkanması.

Son zamanlarda çok küçük parçacık kolonlarının geliştirilmesinde büyük ilerlemeler meydana geldiğinden, bu sorunların her biri, potansiyel çözümleri ile birlikte bir sonraki yazıda ele alınacaktır.

The post Paketlenmiş Kılcal Kolonlar – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).