Normal faz kromatografisi (NPC), proteinlerin saflaştırılması için çok az ilgi görse de, potansiyel uygulaması konusunda artan bir farkındalık vardır. Bu tekniğin ihmal edilmesinin nedeni, birçok proteinin genellikle yüksek oranda organik çözücü içeren mobil fazlarda çözünmez olarak kabul edilmesidir.

Bununla birlikte, birçok proteinin nispeten yüksek bir organik çözücü konsantrasyonunda (ters fazlı kromatografiden sonra) çözünür olduğunu ve bu nedenle doğrudan NPC’ye uygulanabileceğini belirtmek gerekir. Genel olarak NPC, heksan veya dimetil sülfoksit (örneğin membran proteinleri) gibi organik çözücüler içinde kısmen çözünebilen hidrofobik proteinler için kullanılabilir.

Tipik olarak, mobil fazın polaritesini artırmak için sulu mobil fazın organik çözücü içeriği azaltılır. Bir Lichrosorb diol fazında interferonların ayrılması bu prensibi göstermektedir.

Afinite Kromatografisi

Yüksek performanslı sıvı afinite kromatografisi (HPLAC), yakın zamanda tanıtılan bir HPLC formudur ve şu anda birkaç ticari sabit faz mevcuttur: Beckman Fast Affinity sabit faz, LKB ve Biorad’dan sabit fazlar ve Pierce High Performance Affinity sabit faz.

Kullanımları hakkında sadece birkaç rapor mevcuttur ve geçmişte en yakın durağan fazlar ayrı ayrı laboratuarlarda tescilli yöntemlerle hazırlanmıştır.

0,1 M piruvat varlığında laktat dehidrojenazın biyospesifik saflaştırılmasında HPLAC’ın kapasitesinin mükemmel bir kanıtı, hareketsizleştirilmiş adenozin monofosfat kullanılarak gösterilmiştir. Alkol dehidrojenazın ilk elüsyonu, NAD ve 0.1 pM pirazol kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Tersine, proteinler yüksek performanslı sabit fazlara (aktivite kaybı olmaksızın) bağlanabilir ve nükleotid kofaktörlerin hazırlanmasında ve çözülmesinde kullanılabilir. Her kofaktör için ayrılma sabitleri, çözelti çalışmalarından elde edilenlerle olumlu bir şekilde karşılaştırıldı, bu da koenzim bağlanma yerlerinin bozulmadığını gösterir.

Lökosit interferonun saflaştırılmasına yönelik bir araştırma, immünoglobulinlerin eklendiği silika veya agaroza dayalı sabit fazlar için karşılaştırılabilir özelliklerin elde edildiğini gösterdi.

Ligand ‘kanaması’, fiziksel ve kimyasal kuvvetlerden dolayı yumuşak jeller üzerinde afinite kromatografisinde büyük bir problem olmuştur, ancak silika veya polimer mikro kürelerin kullanımı ve gelişmiş birleştirme yöntemleri bu problemin üstesinden gelmelidir.

Boyut dışlama kromatografisi
Boyut dışlama kromatografisi Nedir
Jel Filtrasyon kromatografisi
Afinite kromatografisi
Jel filtrasyon kromatografisi kullanım alanları
Protein saflaştırma yöntemleri
Jel filtrasyon yöntemi
Kolon kromatografisi nedir

Boyut Dışlama Kromatografisi

Proteinler için özel olarak tasarlanmış olan boyut dışlama kromatografisi (SEC) desteklerinin yakın zamanda piyasaya sürülmesi, birçok biyokimyacıyı bunlardan yararlanmaya teşvik etmiştir; bununla birlikte, yaygın bir bulgu, birçok proteinin, durağan faz ile iyonik veya hidrofobik etkileşimler nedeniyle anormal şekilde davranmasıdır.

Şu anda, her bir proteinin ayrılması için ideal koşullar yalnızca deneysel olarak belirlenebilir, ancak genel yönergeler Bölüm 5’te bulunabilir. SEC’in saflaştırma ve tuzdan arındırmada kullanımının yanı sıra, en popüler uygulama, güçlü denatüre edici koşullar vardır.

SEC, bir numunenin saflığını değerlendirirken yüksek moleküler ağırlıklı agregaların tespiti için de kullanılabilir. SEC’de kullanılan mobil fazların, sabit faz ile kimyasal etkileşimi önlemek için, ancak aynı zamanda agregaları bozmayan katkı maddeleri içermesi gerekir, örn. iyonik olmayan deterjanlar, propilen glikol veya hafif kaotropik tuzlar. (Yüksek performanslı SEC uygulamalarının kapsamlı bir listesi Toya Soda Manufacturing)

Peptitler

HPLC, hem sentetik peptitlerin üretiminde hem de doğal olarak oluşan peptitlerin izolasyonunda uzun yıllardır peptitlerin analizi ve saflaştırılması için kullanılmıştır. Tekniğin kullanımına ilişkin kapsamlı bir literatür mevcuttur ve burada alıntılanan örnekler sadece ya son gelişmeleri ya da özel ve yeni uygulamaları açıklamaya hizmet etmektedir.

Ek olarak, peptitlerin ayrılmasında yeni iyon değişim sabit fazının uygulanması, üreticilerin sağladığı literatürde iyi bir şekilde belgelenmiştir. HPLC’nin saflaştırma, karakterizasyon (peptit haritalama), sıralama ve saflık değerlendirmesine uygulanması artık evrensel olarak kabul edilmektedir. Ek olarak, HPLC’ye dayalı başarılı tahliller geliştirilmiştir.

İyon değişim kromatografisi

Peptidlerde ters fazlı iyon çifti HPLC’nin yaygın kullanımı, iyon değişimli HPLC’nin bazı yönlerinden yararlanılmadığı anlamına gelir, örn. peptid haritalaması için. Bir epidermal faktör füzyon peptidinin triptik bir sindiriminden istenen iki bileşenin izokratik ayrımı, 50 mM asetat tamponu, pH 4.0 içinde aşamalı bir sodyum klorür gradyanı ile kombinasyon halinde bir katyon değişim sabit fazı kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Her türün saflığı% 90’dan fazladır. Ters faz ayrımlarının tersine, numune uçucu olmayan bir tamponda yıkanır ve bu da sonraki analizi zorlaştırır. Bununla birlikte, iyon değişim kromatografisi, denatürasyona bağlı olarak ters fazlı kromatografide bazen bulunan bazı artefaktları üretmez.

Ters faz kromatografisi

Peptitlerin ayrılması için ters fazlı HPLC’nin yaygın kullanımı, amino asit bileşimi bilinen bilinmeyen bir peptidin alıkonma süresinin tahmini için tasarlanan bir yöntemle sonuçlanmıştır.

Bir dizi peptidin tutulmasına ilişkin bir çalışmaya dayalı olarak, tutma katsayıları ayrı ayrı amino asitlere atfedilebilir ve bunlar da hidrofobiklikleriyle ilişkilendirilebilir. Bilinmeyen peptiddeki amino asitlerin tutma katsayılarının toplamı, elüsyon konumlarını tahmin etmek için kullanılabilir.

Tutma katsayılarının mutlak değerleri, mobil fazın bileşimine bağlıdır. Bununla birlikte, 10 kDa’dan büyük peptitler, muhtemelen organik çözücü ve pH’ın neden olduğu konformasyonel değişiklikler nedeniyle anormal davranabilir.

Trifloroasetik asit, iyi UV özellikleri ve birçok peptidi çözme kabiliyeti nedeniyle mobil fazda sıklıkla kullanılmaktadır. Diğer mobil fazlar, iyi bilinen tamponlardan türetilir, ancak çoğu belirli durumlarda kullanılamaz. Örneğin asetat tamponlar, 230 nm’nin altındaki yüksek hassasiyette kullanılamaz.

RPC’nin protein dizilemesine ek olarak kullanılması, bir proteinin enzimatik sindiriminden sonra peptit parçalarının izolasyonu için evrensel kabul kazanmıştır.

Her bir peptit, Edman reaktifi ve PTH-amino asitlerin ters faz kromatografisi ile elde edilen dizi ile reaksiyona sokularak işlenebilir.

RPC’nin diğer bir yaygın kullanımı, peptitlerin saflığının değerlendirilmesidir, ancak daha büyük peptitler için, tüm küçük safsızlıkların çözülmesini sağlamak için birden fazla tampon sisteminin kullanılması gerektiği açık hale gelmektedir.

UV tespiti bazı peptitler için tamamen tatmin edici değildir (çünkü tespit tirozin, triptofan ve fenil-alanin varlığına bağlıdır) ve bu nedenle kolon sonrası floresans tespit kullanılarak kapsamlı geliştirme gerçekleştirilmiştir.

The post Boyut Dışlama – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

Mod, sabit fazdaki gözeneklerin farklı moleküler boyutlara sahip moleküllere erişilebilirliğine dayanır ve proteinler, karbonhidratlar ve lipidler gibi yüksek molekül ağırlıklı biyolojik örnekler için özel bir uygulamaya sahiptir. Daha küçük bileşenler gözeneklere daha fazla nüfuz edebilir ve bu nedenle gözeneklerden hariç tutulan daha büyük moleküllere göre kolon üzerinde daha uzun süre tutulur.

Adsorpsiyon Kromatografisi

Bu modda, silika (veya bazen alümina) genellikle sabit faz olarak kullanılır, ancak bu yöntem biyolojik numuneler için yaygın olarak kullanılmaz ve genellikle bağlı normal faz sabit fazlarla değiştirilir. Yöntem, mobil faz ve sabit faz için numunenin farklı afinitelerine dayanır.

 Bölme Kromatografisi

Tüm uygulamaların% 90’a kadarı, iki karışmayan sıvı faz arasında çözünen maddelerin bölünmesine dayanan bu kromatografi modunu kullanır; biri sağlam bir desteğe, diğeri mobil. En popüler sabit faz, oktadesilsilan (OD’ler veya C ,,) kaplı silika partikülüdür, ancak daha düşük homologlar (Cı, C,) de kullanılır.

Ters faz kromatografisinin popülaritesi, zincir uzunluğu, zincir tipi ve karbon yüklemesi bakımından değişen çok sayıda ticari ambalajın mevcudiyeti ile artmaktadır. Bu nedenle, kromatograf sadece hareketli faz bileşimini değiştirerek değişen seçicilik seçimine sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda farklı bir sabit fazı da seçer.

Kromatografiyi fazlamak mümkündür. İyonik yükler, tersine çevrilmiş pH kullanılarak hem iyonize edilmiş hem de iyonize edilmemiş ayrı çözünen maddelerin manipülasyonu veya bir iyon çifti reaktifinin dahil edilmesiyle bastırılabilir.

Daha polar bileşenler için, bağlı normal faz destekleri özellikle yararlıdır ve çözücü bileşimi değişikliklerine hızlı bir tepkiye izin vererek silika üzerinde adsorpsiyon kromatografisine göre faydalara sahiptir.

Ligand değişimi ve afinite kromatografisi gibi diğer bölme kromatografisi modları, suda çözünür biyomoleküllerin çözülmesi için özel uygulamalar bulmuştur.

Afinite kromatografisi
Jel Filtrasyon kromatografisi
İyon değişim kromatografisi
İyon exchange kromatografisi
Adsorpsiyon kromatografisi
Afinite kromatografisi çalışma prensibi
Hidrofobik etkileşim kromatografisi
İyon Kromatografisi

İyon Değişim Kromatografisi

İyon değişim kromatografisinde tutulma, çözünen maddenin karşıt yüklü grupları ile sabit faz arasındaki elektrostatik etkileşimler tarafından yönetilir. Seçicilik, mobil fazın doğasından veya sıcaklıktan etkilenebilir.

Özellikle çok bileşenli örnekler için belirli uygulamalar, bileşenleri yeterince ayırmak için birden fazla HPLC modu gerektirir ve bu, çok boyutlu HPLC kullanılarak sağlanabilir.

 Çözücü Seçimi

Bu bölüm, ilk ilkelerden mobil faz seçimine rehberlik etmek için tasarlanmıştır. Mobil faz bileşiminin seçimi, elde edilebilen büyük ölçüde farklı seçicilikler nedeniyle kritiktir. Bazı durumlarda, son seçimi, kullanılabilirlik ve gider gibi önemsiz faktörler belirleyebilir.

Uygun bir mobil fazın seçimi için esasen üç kriter vardır. Bunlar numunenin fizikokimyasal özelliklerine, çözücülerin fizikokimyasal özelliklerine ve örneğin TLC ile hareketliliğine (mümkünse) dayanmaktadır.

Numunenin Fizikokimyasal Özellikleri

Numune kolona ayırma için kullanılandan farklı bir çözücü içinde uygulanırsa olağandışı kromatografik etkiler gözlemlenebilir.

Örneğin, numune daha güçlü bir çözücü içinde çözülürse, o zaman sütun dengesinin bozulduğu bir bant, sütunda aşağı doğru ilerler ve çoğu zaman çözünürlüğü bozar. Bu nedenle, genel bir kural olarak, numunenin çözünür olduğu bir mobil faz seçmek ve çözünürlük sınırlayıcı bir faktör ise daha büyük bir enjeksiyon hacmi kullanmak her zaman en iyisidir.

Çözücülerin Fizikokimyasal Özellikleri

Çeşitli çözücülerin genel fizikokimyasal özelliklerini göstermektedir. Teoride, bu çözücülerden herhangi biri kromatografi için kullanılabilir, ancak pratik amaçlar için bir dizi çözücü genellikle çeşitli nedenlerle ortadan kaldırılabilir:

(a) yüksek viskoziteye sahip çözücüler, kromatografik kolondaki akış sırasında daha yüksek geri basınçlara neden olur,
(b) düşük kaynama noktalarına sahip çözücülerin hareketli fazda sabit bir konsantrasyonda tutulması zor olabilir ve ayrıca yangın tehlikesi oluşturabilir,
(c) yüksek UV kesme dalga boyuna sahip çözücüler, yaygın olarak kullanılan dalga boyu aralıklarında UV tespitini engeller,
(d) bazı çözücüler toksiktir (örneğin benzen) ve
(e) bazı çözücülerin saflığı partiden partiye değişebilir.

Bu nedenle, yalnızca sınırlı sayıda çözücü genel kullanıma sahiptir. Asetik asit ve trietilamin, bazen iyon değişim kromatografisinde kullanılan sulu tamponların hazırlanmasında kullanıldıkları için dahil edilmiştir.

Son olarak, esas olarak tutulmayı kontrol eden çözücü mukavemeti olsa da, protik çözücülerdeki hidrojen bağının da tutmayı etkileyebileceğine dikkat edilmelidir.

 Numunenin TLC’ye Göre Hareketliliği

Çoğunlukla tek bir çözücü, optimum kromatografik çözülmeye izin vermez ve ayırmaların çoğu, mobil faz olarak çözücülerin bir karışımını kullanır. Optimum mobil faz seçimi genellikle deneme yanılma yoluyla belirlenebilir, ancak TLC kullanılarak bazı kılavuz bilgiler de elde edilebilir.

Teorik olarak, bir TLC plakasındaki mobilite, k ‘= (1 – Rf) / Rf olduğundan, HPLC tutulmasıyla doğrudan ilişkilidir, ancak, TLC dengesiz bir işlem olduğundan ve genellikle daha düşük çözücü kuvvetleri gerektiğinden pratikte farklılıklar vardır. eşdeğer bir HPLC ayırması için. Bununla birlikte, TLC hareketliliği, birçok çözücü karışımını karşılaştırmak için hızlı bir yöntem de sağlar.

Genel olarak, bir numune karışımının ayrıştırılmasının geliştirilmesinde, numune başlangıçta düşük elüsyon kuvvetine sahip bir çözücü içinde HPLC kolonuna enjekte edilir ve daha sonra ilgili bileşikler kolondan ayrılıncaya kadar sürekli olarak da arttırılır.

Bu yöntemin temel sınırlaması, elüsyonun gerçekleştirilmesinin uzun zaman alabilmesi ve sonuç olarak, bu prosedürü, eluent kuvvetinde farklı sıçramalar ile tersine kullanmanın genellikle daha hızlı olmasıdır. Modern ekipman, gradyan geliştirmenin gözetimsiz yürütülmesine izin verir.

Birçok üretici, korozyon olasılığı nedeniyle paslanmaz çelik pompalarda düşük pH değerinde halojenür iyonlarının kullanımından kaçınılmasını önermektedir. Bu nedenle, halojenür iyonlarının kullanıldığı yerlerde, kullanılmadığında sistemden su ile yıkanmaları da tavsiye edilir.

Halide iyonları kullanılırken, pompanın haftada en az bir kez 20 dakika süreyle sistemden (kolondan değil!)% 20 nitrik asit solüsyonu pompalanarak da geçirilmesi tavsiye edilir.

The post İyon Değişim Kromatografisi – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

Bu prosedür, numunenin elüsyonuna ve ligandın aktivitesinin geri kazanılmasına izin verir. Bağın liganda bağlanması muhtemelen bir polimer için çok değerlikli olacaktır (yani çok bölgeli bağlantı) ve bu nedenle sterik olarak bağımlı olabilir.

Tutulmayı etkileyen kritik özellikler, ligand-bağ kompleksi için ayrışma sabiti (Kd) ve durağan fazdaki ligand konsantrasyonudur (bağlanma yerlerinin sayısı). Ayrışma sabiti (Kd), kütle eylem oranı ile tanımlanır.

Afinite kromatografisi için kapasite faktörü (k ‘), basitçe, belirli bir kolon için bağlanmanın serbest bağlantıya oranı olarak tanımlanır ve denklem ile gösterilebilir.

Kd ve k ’arasındaki bir ilişki, analitik ayrımlarda olduğu gibi [Ln]> [Lt] olduğunda türetilebilir. Bu ilişki, çok değerlikli bağlanma için dikkate alınmıştır. Plaka yüksekliğinin K’ye bağımlılığı, concanavalin A’nın eklendiği bir silika desteği kullanılarak not edilmiştir.

Sabit Faz Etkileri

Ligand bağlanmasının kimyası

Ligandların geleneksel sabit fazlara bağlanması için çeşitli yayınlanmış yöntemler mevcuttur ve yüksek performanslı afinite kromatografisi için uygun olan sabit fazların çoğu, bu yöntemlerden bazıları kullanılarak hazırlanmıştır.

Çoğu prosedürde, silika, daha sonra bir reaktif aminin kovalent olarak bağlanabildiği hidrofilik bir tabaka (glikofaz) ile kaplanır. En kararlı destekler ya epoksilika birleştirme ya da tresil-klorür ile aktive edilmiş silika tarafından üretilir.

Diğer özellikler

Parçacık şeklindeki gelişmeler kütle aktarım hızını iyileştirirken desteğin artan sertliği elüsyon ve yeniden dengeleme sırasında daha hızlı akış hızlarına izin verdi. Başarılı ayırmaların çoğunun, sabit faz için bir temel olarak geniş gözenekli (50-100 um) silika partiküllerini kullandığını ve böylece herhangi bir sterik engelden kaçındığını belirtmek de gerekir.

Geleneksel destekler üzerinde yapılan ilk çalışmalardan, bir ara kolun varlığının, muhtemelen ligandın reaktif bölgelerine erişim özgürlüğüne izin vererek bağın bağlanması için faydalı olduğu bulunmuştur. Bununla birlikte, bu kollar ligandın bağlanmasına katılmamalıdır ve bu nedenle hem hidrofilik hem de iyonik olmamalıdır.

Konvansiyonel afinite desteklerinde yüksek derecede ligand ikamesi sağlanabilmesine rağmen, bazı durumlarda bağlanma sırasında yanlış yönlendirme ve denatürasyon kombinasyonundan dolayı potansiyel bölgelerin sadece% 1-2’sinin bağlanma için mevcut olabileceği tahmin edilmiştir. 

Ek olarak, durağan faza bağlanabilen molar ligand miktarı, moleküler boyutun bir fonksiyonudur. Bu, bu tür sabit fazın kapasitesinin, iyon değiştirme veya ters faz sabit fazlardan 100 kat daha az olabileceği anlamına da gelir.

İmmünoafinite durağan fazların hazırlanması için bildirilen durumlarda ligand genellikle 5-10 mg / g reçine konsantrasyonunda bağlanır, ancak bir çalışmada alkol özellikle Cibacron Blue FG3-A’dır.

Bu molekül, enzimlerin katalitik aktivitesi için gerekli nükleotid kofaktörlerinin çoğunu taklit ettiği düşünülen sülfonatlı bir antrakinon parçası içerir.

Ham maya ekstrelerinden, ilgili substratları kullanılarak seçici elüsyonla izole edilen iki enzim, heksokinaz ve 3-fosfogliserat kinaz için bu tip desteğin çözülme gücünün dramatik bir kanıtı gösterildi.

Afinite kromatografisi
Hidrofobik etkileşim kromatografisi
İyon değiştirme kromatografisi
Afinite kromatografisi çalışma prensibi
Jel Filtrasyon kromatografisi
Kromatografik yöntemler
Adsorpsiyon kromatografisi
Kolon kromatografisi

İmmünoafinite

Poliklonal antikor preparatlarının çoğu, Kd = lop8 ila lo – ‘* M sırasıyla ayrışma sabitlerine sahiptir. Bu, maksimum seçiciliğe izin verirken, ligand-bağlayıcı ayrılması, kromatografi sırasında hız sınırlayıcı hale gelebilir, dolayısıyla HPLAC’de kullanımları, hızın gerekli olduğu yerlerde avantajlı olarak kabul edilmeyebilir.

Başarılı bir kromatografiye izin vermek için 0,05-0,1 ml / dk mertebesindeki akış hızları gerekli olabilir ve bu, antikor ligandlarının yüksek performanslı desteklere bağlanma amacını ortadan kaldırabilir. Daha düşük bağlanma sabitlerine sahip monoklonal antikorları seçme olasılığı, tercih edilen bir alternatif sunabilir.

Tablo 9.1, ticari olarak iki sınıfa ayrılan daha popüler afinite ligand tiplerini göstermektedir: katı bir şekilde biyospesifik olarak kabul edilenler ve yapısal veya fonksiyonel bir homolojiyi paylaşan molekülleri ayıranlar. Afinite ligandlarının kapsamlı bir listesi başka bir yerde sunulmuştur, ancak liste sürekli olarak büyümektedir.

Mobilephase efektleri

Seçicilik, nihai olarak ligand-bağ etkileşiminin özgüllüğü ile belirlenir. Bağlanma büyük ölçüde stereospesifik etkileşimler tarafından yönetilse de, Kd elektrostatik, hidrofobik ve bu tür diğer etkileşimlere bağlı olacaktır ve bu nedenle pH ve iyonik kuvvet gibi mobil faz özelliklerinden de etkilenecektir.

Ligand-bağ etkileşiminin kinetik çalışmaları, ligandı birleştirmek için kullanılan farklı yöntemlerden veya ligandın destekten sızmasına bağlı olabilecek çelişkili sonuçlar göstermiştir. (Ligandın destekten sızması, farmakolojik olarak aktif bileşiklerin üretimi için büyük ölçekli afinite desteklerinin kullanımında bir dezavantaj olmuştur.) Kd üzerindeki çözüm çalışmaları, sıcaklık arttıkça Kd’de bir artış olduğunu göstermektedir. ve buna karşılık gelen k ‘değerinde bir azalma olur.

Yüksek Performanslı Ligand Değişim Kromatografisi (HPLEC)

Yüksek performanslı ligand değişim kromatografisinin (HPLEC) geliştirilmesi, HPLAC’den oldukça farklıdır. İvmenin çoğu, amino asitlerin rasemik formlarını ayırma girişimlerinden de kaynaklandı.

Bir yaklaşım, amino veya karboksil grubunun modifikasyonu ve ardından normal faz kromatografisi yoluyla amino asitleri diastereomerik karışımlara dönüştürmekti. Popüler türevlendirme ajanları, izotiyosiyanat ve tiyoüre bileşikleridir.

Halen popüler olmasına rağmen, bu yaklaşım reaksiyon sırasında uzun türetme ve olası artefakt oluşumu dezavantajına sahiptir. Diğer bir yaklaşım, normal veya ters faz kromatografisi sırasında da mobil faza bir kiral ajan eklemektir.

Daha yakın zamanlarda, bir kiral ajanın kovalent olarak bağlanması için durağan fazlardan artan şekilde yararlanılmıştır. Aşağıdaki bölümler bunlarla ilgilenecektir.

Prensipler

HPLEC’in en popüler modu, bazen metal şelat kromatografisi olarak anılır. HPLEC’de bir çözünen maddenin (Lt) tutulması, bir metal iyon-bağ kompleksinin oluşumuna bağlıdır.

Metal iyonun kendisi, durağan faz (SM) ile oluşturulan bir koordinasyon kompleksine bağlıdır. Sabit fazın metal iyon bağlayıcı kompleksi (SMLt) tersine çevrilebilir ve oldukça da düzenli bir yapıya sahiptir.

The post Ligand Değişim Kromatografisi – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

Bu, kritik zincir uzunluğu olarak adlandırılmıştır ve farklı çözünen maddelerle değiştiği bulunmuştur, bu da alkil zincirinin sadece bir kısmının ayırmada yer aldığını düşündürmektedir.

Karbon zinciri uzunluğunun seçicilik üzerindeki etkisi tartışmalı bir konu olmaya devam etmektedir ve bilimsel literatürde bir dizi çelişkili rapor bulunmaktadır. Bu nedenle, spesifik çözünen madde veya mobil faza bağlı olarak artan zincir uzunluğu ile seçicilikte bir artış veya azalma meydana geldiğinde örnekler alıntılanabilir.

Bununla birlikte, ters faz ayrımları için genel bir öneri, tutma daha büyük olduğundan ve seçicilik daha iyi olabileceğinden, bir Cı sabit faz kullanmaktır. Bir ayırma tanımlandıktan sonra, alkil bağlı zincirin uzunluğu, ayırma süresinde bir azalma sağlamak için azaltılabilir. Ancak, bu genellemenin istisnaları olduğu da kabul edilmelidir.

Yüksek Performanslı Ters Fazlı İyon Çifti Kromatografisi

Geleneksel ters faz kromatografisinin en ciddi sınırlaması, iyi pik simetrisini korurken yüksek polar veya iyonik bileşikleri kolon boşluk hacminden ayıramamasıdır. Son yıllara kadar, bu tip bileşikleri içeren ayırmalar için tercih edilen yöntem iyon değişim kromatografısıydı.

Belirli çözünen iyona zıt yüklü bir karşı iyonun eklenmesi ile iyon çifti oluşumu, belirli çözünen iyona bir şarj aracı sağlar ve bir yük nötralizasyonu sağlar ve organik kimyada birkaç on yıldır ekstraksiyon için kullanılmaktadır. Suda çözünür iyonik bileşikler sulu olmayan ortama aktarılır.

Bir kromatografik ayırmada iyon eşleştirmenin ilk uygulaması nispeten yeniydi ve yüklü organik moleküllerin ayrılması için teknikte kullanılan Horvath ve Lipsky’ye atfedildi.

İyon değiştirme kromatografisine popüler bir alternatif olarak iyon çifti kromatografisinin ortaya çıkışı, önceki tekniğin sağladığı çeşitli avantajlara atfedilebilir, bunlara aşağıdakiler dahildir:

(1) Ters fazlı iyon çifti kromatografisi, hem iyonik hem de iyonize olmayan eriyikleri ayırmak için kullanılabilir.
(2) Teknik, ayırmayı etkileyen benzer faktörlerle ters fazlı kromatografiye benzer; bu nedenle, ters faz tekniklerine alışkın olan kromatografi için ters fazlı iyon çifti kromatografisini kullanmak kolaydır.
(3) İyon çifti kromatografisinde kullanılan kolonlar yüksek kromatografik verime sahiptir.
(4) Gradyan elüsyonlarından sonra, orijinal koşulların yeniden kurulması, iyon-çiftli kromatografide iyon değişim kromatografisinde gerekli olabilen oldukça uzun sürelerle karşılaştırıldığında genellikle hızlıdır.

Jel Filtrasyon kromatografisi
Afinite kromatografisi
Sıvı Kromatografisi
Kolon kromatografisi
Adsorpsiyon kromatografisi
Gaz kromatografisi
Kromatografi Çeşitleri
Dağılma kromatografisi

İyon Çifti Kromatografisinin Modları

Şu anda, iyon çifti kromatografisi üç ana sınıfa ayrılabilir: Normal faz sıvı-sıvı iyon çifti (NPLLIP) kromatografisi, ters faz sıvı-sıvı iyon çifti (RPLLIP) kromatografisi ve ters fazlı iyon çifti (RPIP ) kromatografi. Bu kromatografik modların her biri, spesifik avantajları ve dezavantajları ile birlikte şimdi ele alınacaktır.

Normal Faz Sıvı-sıvı İyon Çifti Kromatografisi

Bu teknikte, sabit faz, karşı iyonu içerir ve katı destek (genellikle silika parçacıkları) üzerinde sulu bir kaplamada bulunur. Mobil faz, genellikle küçük miktarlarda ek bir organik modifiye edici içeren, karışmayan, polar olmayan bir organik çözücüdür.

Bu kromatografi modunun sağladığı iki önemli avantaj, mobil fazın değiştirilme kolaylığı ve güçlü bir flüoresan emisyonuna sahip olan spesifik karşı iyonların (pikrat ve naftalin-2-sülfonat gibi) eklenebilmesidir. UV’de yüksek sönme katsayısı; sonuçta ortaya çıkan iyon çiftlerinin oluşumu, başka türlü saptanamayan bazı çözünen maddelerin ölçülmesini de kolaylaştırır.

Bu iyon çifti kromatografisi biçiminin en büyük dezavantajı, kolonun hazırlanmasının kolayca gerçekleştirilememesi ve eşleştirilmiş iyonun durağan fazda tekrar tekrar yeniden üretilmesinin gerekmesidir. Teknik, ters fazlı iyon çifti kromatografisinin, karşı iyonun mobil faza eklenmesi rahatlığına sahip olması gibi basit bir nedenden dolayı yaygın olarak kullanılmamaktadır.

Ters Fazlı Sıvı-sıvı İyon Çifti Kromatografisi

Bu teknik 1970’lerin başında tanıtıldı ve sabit faz olarak kimyasal olarak bağlı bir hidrofobik silika partikül desteği etrafında organik bir kaplama ve karşı iyonu içeren sulu bir mobil faz da kullanır.

Kullanılan organik kaplama genellikle pentan-1-01’dir ve hidrofobik destek oktil veya oktadesil bağlı fazlı silika paketleridir. Bu modda, bir kromatografik ayırma, karşı iyon konsantrasyonunun ayarlanmasıyla veya sabit fazı içeren organik kaplamanın değiştirilmesiyle hem seçicilik hem de tutma süresi için de manipüle edilebilir.

Bu tekniğin normal faz tekniğine göre avantajları, kolonların nispeten kararlı olması ve kromatografik koşulların ayırmaları iyileştirmek için kolayca ayarlanabilmesidir. Dezavantajları, bazı hidrofobik çözünen iyonların sabit faza bölünme eğilimine sahip olmaları ve bu nedenle iyon çifti oluşumuna ek olarak destek üzerinde adsorpsiyon dahil olmak üzere karışık bir tutma mekanizmasına da neden olmasıdır.

Bu tekniğin bir başka dezavantajı, hidrofobik desteğin etrafındaki organik kaplamanın muhafaza edilmesinin gerekmesidir. Sıvı-sıvı kromatografik mod ile ilişkili sorunların üstesinden gelmenin açık çözümü, basit bir kimyasal olarak bağlı hidrofobik sabit faz kullanmaktır ve bu nedenle günümüzde çabaların çoğu ters fazlı iyon çifti kromatografisi üzerinde de yoğunlaşmıştır.

Ters Fazlı İyon Çifti (RPIP) Kromatografisi

RPIP kromatografisi, bir hidrokarbonlu sabit faz ve karşı iyonu da içeren sulu veya sulu-organik bir mobil faz kullanır. Sabit faz genellikle oktadesil bağlı fazdır ve mobil faz genellikle organik modifiye edici olarak metanol veya asetonitril içeren sulu bir tampondur.

Karşı iyonların seçimi, ayrılacak çözünen maddelere bağlıdır, ancak genel olarak asitlerin ayrılması için mobil faza hidrofobik bir organik baz eklenirken, bazların ayrılması için bir hidrofobik organik asit eklenir. Diğer bileşiklerin ayrılması benzer şekilde uygun bir karşı iyon ilave edilerek de elde edilir.

The post İyon Çifti Kromatografisinin Modları – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).