Ekipman

Hücre içi PCR gerçekleştirmek için, standart bir termal döngüleyici (değişiklikler kullanarak), termodöngü fırınları ve özel olarak tahsis edilmiş termo döngüleyiciler (Applied Biosystems Gene Amp in situ PCR sistemi 1000; Hybaid Omnigene/ Omnislide ve MJB slayt termocycler) arasında değişen çeşitli araçlar mevcuttur. hücre içi DNA ve RNA amplifikasyonu için kullanılır.

Standart bir termal döngüleyici kullanılıyorsa, slayt için bir amplifikasyon odası oluşturulmalıdır. Bu alüminyumdan yapılabilir (alüminyum folyo tekne). Sürgüyü içeren bu tekne, termal döngüleyiciye yerleştirilir, mineral yağ ile kaplanır ve ardından tamamen sarılır. Ancak, ısıl iletimin optimizasyonu hiçbir zaman tam olarak sağlanamaz.

‘Termal gecikme’, yani In situ immüno-PCR’deki farklılıklar: in situ immünoanalizler, in situ PCR ile erişilebilen hedef moleküllerin dakika sayısının saptanmasına izin vermez. In situ immüno-PCR, DNA markörünün bir antikor-biyotin-avidin köprüsü aracılığıyla hedef moleküllere bağlandığı ve in situ PCR ile amplifiye edildiği bir reaksiyondur. Amplifiye edilmiş DNA dizileri daha sonra hibridizasyon ile yerinde tespit edilir.

Bu tekniğin yaratıcıları, tekniğin bozulmamış hücrelerde veya doku kesitlerinde proteinler, karbonhidratlar ve lipidler gibi biyolojik makro moleküllerin çok küçük miktarlarını tespit edebilen tek teknik olabileceğini iddia ediyor.

Reaksiyon döngüsünün her bir sıcaklık adımında blok yüzü, cam slayt ve PCR reaksiyon karışımı arasındaki sıcaklıkla yaygın olarak karşılaşılır. Bu problem, daha büyük termodinamik kontrol ile dahili slayt sıcaklık kalibrasyon eğrileri sunan, özel olarak tasarlanmış yerinde amplifikasyon makinelerinin kullanılmasıyla aşılır.

Amplifikasyon Tıp
Gen amplifikasyonu
Hedef amplifikasyon nedir
Elektronik amplifikasyon nedir
Sinyal amplifikasyon nedir
Pcr amplifikasyon nedir
Sinyal amplifikasyonu ne demek
Her2 gen amplifikasyonu nedir

Başlangıç ​​Malzemesi

1990 yılında Haase ve ark. başlangıçta in situ PCR, PCR reaksiyon tamponunda süspanse edilmiş, bozulmamış sabit tek hücrelerde tarif edilmiştir. Amplifikasyondan sonra hücreler cam slaytlar üzerinde sitosantrifüjlendi ve amplifiye edilen ürün in situ hibridizasyon kullanılarak saptandı.

Başlangıçta, bazı araştırmacılar standart Eppendorf tüplerinde doğrudan PCR reaksiyon tamponunda inkübe edilen cam slayt parçaları (sitosantrifüj preparatlarından hücrelerle) kullandılar. Daha yakın zamanlarda, mikroskop slaytlarına bağlı doku ve hücreleri kullanan teknikler kullanılmıştır.

IS-PCR, PCR-ISH, IS-LCR, IS-PNA PCR ve IS-TaqMan PCR için, amplifikasyon için arşiv parafine gömülü materyal dahil sabit hücreler ve dokular kullanılabilir. Eski arşiv materyali (40 yıla kadar) ile başarılı amplifikasyon elde edilmiş olmasına rağmen, en iyi sonuçlar taze sabitlenmiş hücreler ve dokularla elde edilir.

Sabit metafaz kromozom yayılımları ve interfaz çekirdekleri, PRINS ve döngüsel PRINS kullanılarak spesifik alt kromozomal bölgelerin tespiti için kullanılabilir (Gosden ve diğerleri, 1991). Amplifikasyon reaktiflerine en az amplifiye ürün sızıntısı ile erişime izin veren uygun bir mikro ortam sağlayan sert bir hücresel hücre iskeleti oluşturulmalıdır.

%1-4 paraformaldehit, nötr tamponlu formaldehit (NBF) ve %10 formalin içinde sabitlenmiş dokularla tatmin edici sonuçlar elde edilir (biyopsi/katı doku için 12-24 saat; sitolojik hazırlıklar için 10-30 dakika). Etanol ve asetik asitle sabitlenmiş dokularla daha az tutarlı sonuçlar elde edilir.

Hücrelerin formaldehit fiksatifleri ile fiksasyonu bir takım dezavantajlar sağlar. Aldehit grupları, DNA-DNA ve DNA-histon protein çapraz bağları oluşturmak için DNA ve histon proteinleri ile reaksiyona girer. Formaldehit fiksasyonu ayrıca künt uçlu olmayan (yani örtüşmeyen uçlar) DNA şablonunu (dsDNA’da rastgele kırılmalar) “çentikler”.

Bu çentikler daha sonra Taq DNA polimeraz için potansiyel hazırlama bölgeleri olarak hareket edebilir ve apoptoz için in situ uç etiketlemeye benzer şekilde etiketli ve etiketsiz nükleotidlerin (yani dATP vb.) dahil edilmesine ve uzamasına yol açar.

Bu işlem oda sıcaklığında gerçekleşir ve DNA IS-PCR ile sahte sonuçlara yol açar. Hücre içi DNA ve RNA PCR’nin (yani bir hibridizasyon aşaması olmadan) büyük ölçüde terk edilmesinin baskın nedeni budur.

Yerinde amplifikasyon sırasında tekrarlanan ısıtma ve soğutma döngüleri kullanıldığından, hücreler ve dokular, ayrılma meydana gelmemesi için katı bir desteğe (genellikle cam) yeterli şekilde bağlanmalıdır. Cam slaytlar, en yaygın olarak aminopropil-trietoksisilan (APES), Denhardt solüsyonu ve Elmer yapıştırıcısı olan maksimum kesit yapışmasını sağlamak için kaplama ajanları ile ön işleme tabi tutulur.

Hücre ve doku geçirgenliği

Reaktiflerin erişimini kolaylaştırmak için hücreler yeterince sindirilmeli ve geçirgenleştirilmelidir. Bu, proteaz muamelesi (örneğin, proteinaz K, pepsin veya tripsin) ve/veya hafif asit hidrolizi (0.01-0.1 N HCl) ile elde edilebilir. Maksimum sindirim süreleri ve proteaz konsantrasyonları, kullanılan her doku/sitolojik preparasyon için optimize edilmelidir.

Uzun sindirim süreleri kaçınılmaz olarak hücresel morfolojiyi tehlikeye atar. Kısa sindirim süreleri, sonuçta doğal DNA şablonları boyunca Taq DNA polimerazın ilerlemesini engelleyebilecek olan histon protein-DNA çapraz bağlarının eksik ayrışmasıyla sonuçlanır. Asit hidrolizi muhtemelen bu tür çapraz bağları tam ayrışmaya yönlendirerek etki eder.

Alternatif olarak, nükleik asit şablonlarını açığa çıkarmak için hücrelerin ve doku bölümlerinin mikrodalga ışınlaması kullanılabilir. İmmünositokimya için antijen alımına benzer bir sitrat tamponu kullanılarak kısa mikrodalga ışıması (proteolizli veya proteolizsiz) darbeleri, amplifikasyon reaktiflerinin istenen hedef diziye erişmesine izin verir ve ayrıca amplifikasyon sonrası immünositokimyayı kolaylaştırır.

Bunu takiben (izotopik olmayan bir etiketleme yöntemi kullanılıyorsa), ürünün amplifikasyon sonrası tespiti için kullanılan yönteme bağlı olarak bir bloke etme adımı kullanılmalıdır, örn. peroksidaz veya alkalin fosfataz tespit sistemleri. İlkinde, endojen peroksidaz, sodyum azid ile %3’lük bir H2O2 solüsyonunda inkübasyon yoluyla söndürülürken, %20 buz gibi soğuk asetik asit, intestinal alkalin fosfatazı bloke eder.

DNA amplifikasyon protokolleri

Başarılı amplifikasyon aşağıdakiler tarafından yönetilir: (a) döngü parametrelerinin dikkatli optimizasyonu; (b) primer çiftlerinin uygun tasarımı (Tm’leri, yani spesifik erime sıcaklıkları, primer dimerleri oluşturma yetenekleri ve benzersizlikleri dikkate alınarak); ve (c) amplifikasyon reaksiyonunu yürütmek için gerekli olan Mg2+ konsantrasyonlarının optimizasyonu yer alır.

The post Amplifikasyon – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae ve Trichomas vaginalis gibi cinsel yolla bulaşan hastalıkların tespiti için, tamponla toplanan numuneler kullanılarak kendi kendine uygulanan yeni numune alma tekniklerinin, idrar analizine göre PCR tarafından daha hassas olduğu kanıtlanmıştır.

Amplifikasyon enzimleri, EDTA ve heparin gibi örnek toplamada kullanılan reaktifler tarafından da inhibe edilir. Hedef bol miktarda mevcutsa, numunenin seyreltilmesi, nükleik asidi sıfır kopya örnekleme sıklığının düşük olduğu bir seviyede tutarken inhibitör etkiyi ortadan kaldırabilir.

Bunun aksine, nükleik asidin enzimatik veya kimyasal olarak yok edilmesi, amplifiye edilebilir nükleik asit hedeflerinin etkili sayısını azaltacaktır. Hedef organizma ve hücre duvarının dayanıklılığı, ekstraksiyon prosedürü üzerinde önemli bir etkiye sahip olacaktır, örn. M. tuberculosis’in hücre duvarı parçalanmaya özellikle dirençli iken, Myco-plazma spp. kendiliğinden eriyecek.

Amplifikasyon Tıp
Hedef amplifikasyon nedir
Gen amplifikasyonu
Sinyal amplifikasyon nedir
Elektronik amplifikasyon nedir
Pcr amplifikasyon nedir
Sinyal amplifikasyonu ne demek
Ses amplifikasyon nedir

M. tuberculosis gibi patojenler hedef organizma olduğunda, moleküler teknikler kullanan laboratuvar personelini korumak da önemlidir. Bu nedenle, ekstraksiyon prosedürüne sterilizasyon adımlarının dahil edilmesi gerekli olabilir. Özel ekipman gereksiniminin azalmasıyla minimum örnek işleme ve sağlam protokoller gereklidir.

Bakteriyel DNA’nın geniş aralıklı amplifikasyonu, bir dizi hedef organizmadan DNA’yı serbest bırakan ve inhibe edici faktörleri ortadan kaldıran örnek işlemeyi gerektirir. Parçalanması zor hücre duvarlarına sahip organizmaların gelişmiş tespiti için, ek bir sonikasyon adımı ile cam elyaf filtre kolonları ile DNA saflaştırmanın standart fenol-eter DNA ekstraksiyonu kadar iyi olduğu kanıtlanmıştır.

Örnek hazırlama prosedürleri, klinik örneklerde hedef saptamanın güvenilirliğine katkıda bulunur; Çok sayıda ticari kit mevcuttur ve DNA ekstraksiyon tekniklerinin özellikle örnek türüne göre dikkatlice seçilmesi şiddetle tavsiye edilir.

Ticari kitlerin dışkı örneklerinden DNA ekstraksiyonunda ve Plasmodium falciparum’un moleküler epidemiyolojik çalışmaları için hızlı DNA ekstraksiyonunda üstün olduğu kanıtlanmıştır; yine de ticari olmayan yıkama / alkali / ısı lizizinin, kan kültürü materyalinden bakteri, maya ve mantar DNA’sının ekstraksiyonu için en hassas ve basit yöntem olduğu kanıtlanmıştır.

Bazı çalışanlar, özellikle bağırsak protozoası ile ekstrakte edilmiş DNA’nın geri kazanımını ve saflığını en üst düzeye çıkarmak için ticari kitleri modifiye etti. Numune hazırlama yetersizse, yanlış negatif sonuçlar üretilebilir.

Amplifikasyon

Nükleik asit hedefleri, DNA veya RNA, çift veya tek sarmal olabilir ve izole edildikten sonra bozunmaya karşı stabilize edilmelidir. RNA’nın stabilize edilmesi DNA’dan daha zordur. Kirletici DNA bulunmaması, RNA izolasyonu için bir gerekliliktir. DNA veya RNA’nın seçici ekstraksiyonu veya yok edilmesi, kişinin uygun nükleik asidi hedeflemesine izin verir. rRNA kaotrop solüsyonlarda oda sıcaklığında aylarca stabilize edilebilir.

Yaşam döngülerinde bir RNA ve bir DNA aşamasına sahip olan patojenler sorunludur. Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) genellikle mRNA’yı tespit eder, ancak bu hedefi yok etmek için adımlar atılmadıkça DNA’yı da tespit eder.

Nükleik asit sekansına dayalı amplifikasyon (NSABA), mRNA’yı saptamak için de kullanılabilir; bu, termal döngüleyici gerektirmeyen izotermal bir reaksiyondur. Daha yakın zamanlarda, ters transkriptaz-sarmal yer değiştirme amplifikasyonu (RT-SDA) da bakteriyel canlılığın bir göstergesi olarak kullanılmıştır.

Teorik olarak yalnızca RNA şablonlarını kullanabilen kendi kendini sürdüren sekans replikasyonu (3SR) gibi amplifikasyon yöntemleri, ekstraksiyon tekniğinin bir parçası olarak bir denatürasyon adımı dahil edilmedikçe DNA’yı amplifiye etmemelidir. Tek sarmallı DNA’nın bu RNA’ya özgü yaklaşıma gerçekten müdahale edip etmediğini belirlemek önemlidir.

Analojik olarak, PCR ters bir transkripsiyon adımı PCR’den önce gelmedikçe sadece DNA’yı tespit edecektir. Adli patolojide kan ve semen lekelerinin araştırılması, DNA ve RNA’nın etanol çökeltme asidi fenol / kloroform ekstraksiyonu kullanılarak analiz için aynı örnekten aynı anda izole edilebileceğini göstermiştir.

Stabil nükleik asitleri hedefleyen amplifikasyon yöntemleri, ölü, hareketsiz ve replike olan organizmaları tespit edebilir. Organizmanın tüm formlarının tespiti, taşıma veya saklama sırasında canlılık hızla kaybolduğunda veya organizma kültürlenemediğinde avantajlı olabilir. Bununla birlikte, ölülerin canlı organizmalardan ayrılması, eğer canlı olmayan veya hareketsiz organizmalar aktif enfeksiyon ortadan kalktıktan sonra kalırsa bir sorun teşkil edecektir.

Kalite Kontrol

İzole edildikten sonra hedef, amplifikasyonla uyumlu sulu bir ortama yerleştirilmelidir. Amplifikasyon enzimleri, nükleik asitlerin saflaştırılması için moleküler biyolojide kullanılan birçok reaktif tarafından inhibe edilir; bunlar sodyum dodesil sülfat (SDS) gibi deterjanları veya özellikle kan ürünlerinden bakteri ve maya DNA’sının ekstraksiyonunda hücre zarlarını çözündürmek veya nükleazları inaktive etmek için kullanılan guanidinyum HCl gibi kaotropları içerir.

Bu tür reaktifleri çıkarmak veya nötralize etmek için ek adımlar atılmalıdır. Klinik moleküler biyoloji tekniklerinde reaktiflerin ve ekipmanın kalite kontrolü son derece önemlidir. PCR kadar güçlü ve hassas tekniklerle, kontaminasyon nedeniyle yanlış pozitif reaksiyon riski ve reaksiyon inhibitörleri nedeniyle yanlış negatifler riski, tekniği nispeten pahalı hale getiren titiz kaçınma prosedürlerine yol açmıştır ve bu da tekniği göreceli olarak pahalı hale getirmiştir. 

Tanısal mikrobiyolojide özellikle önemli olan, yanlış negatiflerden kaçınmak için ek kontrollerin kullanılmasıdır, yani bir kontrol sekansının düşük kopya sayısının intrinsik DNA kontrolleri klinik numuneye eklenebilir. Kontrol amplifiye olmazsa, örneğin inhibitör olduğu varsayılabilir.

Özel ekipman gereksinimleri, tıkalı uçları veya pozitif yer değiştirmeli pipetleri, ayrı iş istasyonlarını, termocycler’ları ve algılamaya dayalı ekipmanı içerir. Hepsi büyük bir ilk mali harcama gerektirir. Doğrulama eksikliği ve standart protokollerin yanı sıra değişken kalitedeki reaktifler ve ekipman nedeniyle, moleküler teknikler hala referans laboratuarlarının ve araştırma birimlerinin aracıdır.

Avrupa Komisyonu, gıdalardaki patojenik bakterilerin tespiti için tanısal PCR kullanımının geçerliliği ve standardizasyonu ile ilgili araştırmaları onaylamıştır ve gelecekte klinik tanıdaki benzer gelişmelerin nihayetinde daha genel kullanıma yol açabileceği umulmaktadır.

The post Amplifikasyon – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).