Güçlü bir teşhis ve araştırma aracı olmakla birlikte, CGH’nin bir sınırlaması vardır, çünkü görselleştirme için metafaz kromozomlarının yoğunlaştırılmış durumlarını kullanır, bu da örtüşen sinyalleri birbirine yakın genlerden ayırt etmeyi zorlaştırır, böylece bir ilgi dizisinin kesin lokalizasyonu belirlenir.

Kopya numarası kaybını algılama çözünürlüğü 10 MB’den büyük veya buna eşittir ve kopya numarası kazanımları için 2 MB’den az değildir. CGH’nin sunduğu bir diğer zorluk, sitogenetik konusunda eğitim almış, kopya numarası değişikliklerinin lokuslarını belirleme ve belirleme becerisine sahip deneyimli teknik personele duyulan ihtiyaçtır.

1995 yılında Schena ve ark. karşılık gelen bitki genlerinin ekspresyonunu nicel olarak ölçmek için bitkilerden alınan gene spesifik hibridizasyon hedeflerinin cDNA klonlarının kullanıldığı mikrodiziyi geliştirdi. Bu yeni bilimsel aracın başarısı, insan genom analizi için mikrodizilerin kullanılmasına yol açtı ve böylece tüm insan genomunun bir temsilini tek bir slayta yerleştirmemize izin verdi.

Mikrodiziler veya “çipler”, yaygın olarak bilindikleri gibi, cam, krom, silikon vb. gibi katı bir yüzey üzerinde bir ızgara şeklinde hareketsiz hale getirilen bireysel nükleik asit numunelerinin düzenli düzenlemeleridir.

Mikroarray analizi artık DNA dizi varyasyonu, gen ekspresyonu, protein seviyeleri, dokular ve hücrelerin kapsamlı bir paralel formatta analizine izin veren de temel bir teknolojidir.

Mikrodizilerin geliştirilmesinden bu yana, geleneksel CGH’nin tanınan sınırlamaları, onu mikrodizi teknolojisine bağlayarak aşılmıştır. Metafaz kromozomlarını kullanmak yerine, slaytlara bağlı genomik DNA dizilerine CGH uygulanır. Bu sistem, dengesiz bölgelerin saptanması için çözünürlüğü önemli ölçüde artırır ve deneyimli sitogenetikçilere olan ihtiyacı da ortadan kaldırır.

Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon
Array CGH Nedir
Array CGH Testi fiyatı
Array CGH yöntemi nedir
Mikroarray
Microarray
Ngs Nedir

Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyona Genel Bakış

CGH, yeşil bir florokrom ile etiketlenmiş, kırmızı bir florokrom ile etiketlenmiş normal (diploid) DNA ile karıştırılmış (1:1) hastalığa veya tümöre özgü DNA’nın kullanılmasını içerir. Bu karışım, bir cam slayt üzerinde normal metafaz insan preparatlarına da hibritlenir.

Etiketli DNA fragmanları, kromozomların metafaz yayılımı üzerindeki orijin lokuslarına hibridizasyon için rekabet eder ve tümör DNA’sının hibridizasyonu yeşil flüoresans ile temsil edilirken, normal DNA’nın hibridizasyonu kırmızı flüoresan ile tde emsil edilir.

Herhangi bir lokusta bağlanan tümör ve referans DNA’nın nispi miktarları, iki DNA örneğindeki bu dizilerin nispi bolluğuna bağlıdır. Ortaya çıkan yeşil:kırmızı floresan oranı, genetik materyalin kaybı veya kazancının en nicel temsilidir.

Kısacası, gen kopya sayısı kazanımı (amplifikasyon), yüksek bir yeşil:kırmızı oranı üretir ve belirli bir lokusta kopya sayısı kaybı (silme), azaltılmış bir yeşil:kırmızı oranı ile de sonuçlanır.

Normal metafaz slaytları, normal bir karyotipe sahip bir insandan alınan fito-hemagglutinin ile uyarılan periferik kan lenfosit kültürlerinden hazırlanır. Hücreler mitozda durdurulur, hipotonik KCL ile muamele edilir, metanol veya asetik asit içinde sabitlenir ve örtüşen kromozomların sayısını en aza indirmeye özel dikkat gösterilerek slaytlar üzerine de monte edilir.

Yüksek kaliteli preparasyonlar için çok az sitoplazma olmalı, böylece arka plan seviyeleri minimumda tutulmalıdır; faz kontrast mikroskobunda bakıldığında kromozomlar koyu olmalıdır; ve ayrıca yeterli uzunlukta olmalıdırlar. Tabii ki, bu zaman alıcı çalışmaya bir alternatif olarak, tamamen hazırlanmış metafaz slaytları ticari olarak da mevcuttur.

Avantajlar

CGH, DNA dizisi kopya sayısı artışlarını ve azalmalarını genomun herhangi bir yerinde saptamayı ve haritalamayı mümkün kılar, kazanç ve kayıpların genel sıklığı, bu değişikliklerin kromozomal alt bölgelerdeki kümelenmesi ve bölgelerin boyutu ve sayısı hakkında bilgi sağlar herhangi bir tümör örneğinde de etkilenir.

Tek bir deneyde tüm genomu araştırma yeteneği, aynı anda yalnızca bir lokus hedefleyen alelik kayıp çalışmalarına göre belirgin de bir avantajdır.

CGH, analiz edilecek hücrelerden metafaz yayılmalarının hazırlanmasını gerektirmez; bu, katı tümörlerin bantlama analizinde çok zor olabilir, bu nedenle CGH, özellikle gelişmiş DNA ekstraksiyon tekniği ve evrensel PCR amplifikasyonu nedeniyle katı tümör analizinde kullanım için idealdir. formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü dokular dahil hemen hemen her tür klinik örnekten daha yüksek DNA verimi elde edilmesine de izin verir.

Spesifik bir prob veya önceden genomik değişiklikler bilgisi gerekmediğinden, CGH çok önemli genlerin konumlarına yol açan önceden bilinmeyen sapmaların tanımlanması ve haritalanması için de oldukça çok uygundur.

Sınırlamalar

CGH kritik bir araç olduğunu kanıtlamıştır; ancak, bir takım sınırlamaları vardır. İlk olarak, yalnızca kopya kazancını ve kaybını algılayabilir. Kopya kazancı veya kaybı içermeyen herhangi bir yapısal kromozomal değişikliği tespit edemez, örn. dengeli translokasyonlar veya inversiyonlar. Bu nedenle, başlıca genetik kararsızlığın kromozomal dengesizlik olduğu epitelyal tümörlerin analizinde en uygundur, ancak hematolojik veya mezenkimal tümör analizinde o kadar yararlı da değildir.

İkincisi, kromozom içindeki hedef DNA süper sargılı olduğundan, tespit edilebilecek DNA sapmasının minimum boyutu bir sorun teşkil eder, yani kayıp için çözünürlük 10 Mb’dir ve bu tespit edilebilirlik seviyesi bir fonksiyon olduğu için hem sapma boyutu hem de fazla kopya sayısı açısından kazanç çözünürlüğü de 2 Mb’dir.

Bu sınırlama, ilgilenilen dizilerin kesin lokalizasyonunu engeller. Ayrıca, katı tümör analizinde, tümör hücrelerinin normal hücrelerle kontaminasyonu nedeniyle küçük kopya sayısı değişikliklerini tespit etmenin zor olduğu da belirtilmelidir. Kirlenmeyi azaltmak ve böylece algılama hassasiyetini artırmak için saf hücre popülasyonlarının mikrodisseksiyonla izole edilmesi de önerilir.

Ayrıca, 1p32, 16p ve 19p kromozom bölgelerindeki yüksek sayıda tekrarlayan diziler nedeniyle, bu bölgelerin analizi güvenilir olmayabilir. Son olarak, homojen olmayan veya granüler boyama modelleri, yüksek miktarda proteinle kontamine olmuş numune DNA preparatlarından veya çok kısa veya çok uzun etiketli parçalardan da kaynaklanabilir.

The post Genomik Hibridizasyon – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

Bu teknoloji ile robotik bir yazıcı kullanılarak küçük miktarlardaki prob bir cam slayt üzerine yerleştirilir. Problar cDNA, oligonükleotidler veya PCR ürünlerinden oluşabilir, her prob spesifik bir gene tamamlayıcıdır. Hedef etiketleme ve mikrodizilere hibridizasyon protokolü, Affymetrix GeneChip teknolojisi ile kullanılandan farklıdır.

İki farklı RNA örneğindeki her bir genin nispi bolluğunu karşılaştırmak için iki renkli bir hibridizasyon deneyi yapılır. Toplam RNA, iki farklı florofor kullanılarak etiketlenmiş iki numuneden ekstrakte edilir. Floresan raportörler örtüşmeyen spektrumlar, Cy3 (540 nm’de yeşil emisyon) ve Cy5 (650 nm’de kırmızı emisyon) ile seçilir. 

Bu flüoresan etiketleri, flüoresan nükleotidler Cy3-dUTP veya Cy5-dUTP varlığında bir oligo dT primeri ile doğrudan ters transkripsiyon yoluyla veya dolaylı olarak bir T7 RNA amplifikasyon adımında dahil edilebilir.

Test ve referans numunesinden gelen etiketli cDNA veya cRNA birlikte karıştırılır, dahil edilmemiş boyalar çıkarılır ve karışım mikrodiziye hibridize edilir. Cy3:Cy5 oranı belirlenir ve sırayla iki numunede bu spesifik dizinin nispi bolluğu belirlenir.

MWG Mikrodizileri

MWG mikrodizileri, CodeSeq1 veri tabanından tasarlanan oligonükleotid setleri ile tespit edilir. CodeSeq1 veritabanı, her bir gen için genel dizilerden türetilen, fazlalık olmayan, proteinle ilgili bir MWG veri tabanıdır; her bir transkript için fazlalık ve kısmi diziler kaldırılır. Dizilerdeki spesifik genler ve transkriptler, GC içeriği ve TM’de eşleşen ve ikincil yapılardan arınmış spesifik 50-mer oligonükleotitler ile temsil edilir.

Veri işleme ve ikincil analiz

İnsan genomunun dizili araştırmalarından çıkan büyük miktardaki veri etkileyici olabilir, ancak yorum olmadan geriye kalan tek şey bu – bir veri yığını. Gen işlevi, araştırmacıların mikrodizi deneylerinden çıkarmak istedikleri temel unsurlardan biridir ve bu amaçla çeşitli ikincil analitik araçlar mevcuttur.

Belki de mikrodizi teknolojisinin göreli yeniliği veya teknolojinin genişleme hızındaki hızlanma nedeniyle, mikrodizi verilerinden ikincil analiz sunumu standardizasyon eksikliğinden zarar görmüştür. Mikrodizi ekspresyon çalışmaları, çok büyük miktarlarda transkriptomik veri üretebilir. Bu tür veriler, gen fonksiyonu ve çeşitli metabolik yollardaki etkileşim hakkında içgörüler üretebilir.

Gen ifadesi verileri doğası gereği karmaşıktır. Kullanılan dizi tipi, incelenen biyolojik materyalin doğası, RNA örneği ile kullanılan protokoller ve seçilen kalibratörün doğası gibi bir dizi parametre bağlamında analiz edilmelidir.

Array CGH Testi fiyatı
Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon
Array CGH Nedir
Array CGH yöntemi nedir
Mikroarray yöntemi Nedir
Microarray
Ngs Nedir

Mevcut mikrodizilerin kendi başına ifadeyi ölçmediği veya nicelleştirmediği göz önüne alındığında, bu son faktör özellikle önemlidir; bunun yerine, bir kalibratör numunesi ile karşılaştırıldığında bağıl veya kat değişiklikleri hesaplanır. Kullanılan kalibratörler arasında standardizasyon eksikliği, farklı kaynaklar tarafından oluşturulan verileri karşılaştırmaya çalışırken en önemli kafa karıştırıcı konulardan biridir.

Farklı dizi platformları ve deneysel tasarım da standartlaştırılmamış verilere katkıda bulunur ve doğrudan karşılaştırmaları imkansız olmasa da zorlaştırır.

Yakın zamanda Brazma ve ark. (2001, 2002), mikrodizi verilerini standartlaştırmak amacıyla bir sistem önerdi. Bu yazarlar, üretilen sonuçların yorumlanabilirliğini ve ayrıca potansiyel bağımsız doğrulamalarını sağlamak için rapor edilmesi gereken minimum bilgiyi tanımlamayı amaçladı.

Sistemleri, MIAME (Mikroarray Deneyi Hakkında Minimum Bilgi) kısaltmasını taşır. MIAME sistemiyle, bir mikrodizi deneyinden elde edilen veriler ve açıklamaların aşağıdaki kısıtlamalara uyması gerekir: ‘Her deneyle ilgili kaydedilen bilgiler, deneyi yorumlamak için yeterli olmalı ve benzer deneylerle karşılaştırmaları mümkün kılacak ve izin verecek kadar ayrıntılı olmalıdır. çoğaltma’ ve ‘bilgi, yararlı sorgulama ve otomatik veri analizi ve madenciliği sağlayacak şekilde yapılandırılmalıdır’.

MIAME’yi destekleyen bir diğer ilke, bölgenin hızla geliştiği imtiyazıdır. Standartların, ilgili tarafların sonuçlara nasıl ulaşıldığını anlamalarını kolaylaştırmak için yalnızca verilerin yeterli ayrıntıda tanımlanmasını ve açıklamaları gerektirmesi gerektiğini öne sürer.

Program, bir mikrodizi deneyinin temel değişken bileşenlerini detaylandırır ve bu alanla ilgili herhangi bir yazıya dahil edilmesi gereken noktaları gösterir. Son olarak sistem, mikrodizi teknolojisinin ifade analizi (örneğin SNP profili oluşturma) dışındaki amaçlar için kullanımını kabul eder ve sistemlerin diğer sürümlerinin bu yönü barındırması planlanır.

İnsan Dokularının CGH Dizi Analizi

CGH’nin arka planı ve CGH dizisi

Tarihsel olarak, katı tümörlerin sitogenetik analizinin zor olduğu kanıtlanmıştır ve katı tümörlerde yer alan genetik değişikliklerin saptanması için kullanılan birçok teknik olmasına rağmen, hepsinin sınırlamaları vardır.

Aneuploid klonları tespit etmek için kullanılan görüntü sitometrisi, küçük genetik değişiklikleri tespit etmek için yeterince hassas değildir, oysa karyotipleme son derece uzmanlaşmış olması, zaman alıcı olması ve katı tümörlerin doku kültürünü gerektirmesi nedeniyle kendi zorluklarını sunar. güvenilmez olmak.

Heterozigotluk kaybı çalışmaları ve floresan in situ hibridizasyon (FISH) çalışmaları aslında bize aynı anda bir veya az sayıda spesifik gen veya kromozom bölgesi hakkında çok ayrıntılı bilgi sağlar; bununla birlikte, bize tüm genom hakkında bir genel bakış sağlayamazlar.

1992’de Kallioniemi ve ark. tek bir deneyde tüm genom boyunca nispi DNA dizi kopya sayısı varyasyonunu saptayıp haritalayabilen karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) adlı moleküler sitogenetik bir yöntem geliştirdi.

Bu devrim niteliğindeki teknik, nispeten az miktarda DNA kullanır ve hücre kültürüne ihtiyaç duymadan tüm genomu araştırmamıza ve tüm kromozomlardaki kayıp ve kazanımları bir kerede tespit etmemize olanak tanır.

Kallioniemi’nin California Üniversitesi, San Francisco’daki grubu, başlangıçta 11 kanser hücre hattında yeni kromozomal anormallikleri tespit etmek için CGH kullandı ve o zamandan beri bu tekniğin genetik değişiklikleri tespit etmek için kullanımına ilişkin literatür hızla büyüyor ve gelişiyor.

Bu tekniğin avantajı, geleneksel FISH’den daha az zaman ve emek harcayan genom çapında tarama yeteneğidir. CGH’nin kanser araştırmalarındaki uygulamaları, tümörlerin genetik anormallikler için taranmasını ve tümör progresyonu ve prognozu konusundaki anlayışımızı artırmak için tümörlerdeki genetik değişiklik profillerinin analiz edilmesini içerir.

The post CGH Dizi Analizi – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).