Nükleik asit dizisine dayalı amplifikasyon (NASBA), TMA’ya yüzeysel olarak oldukça benzerdir; bununla birlikte, TMA bir izotermal amplifikasyonda iki enzim kullanırken, NASBA üç enzim kullanır. Tescilli bir silika bazlı nükleik asit ekstraksiyon yöntemi kullanılarak nükleik asidin ekstraksiyonundan sonra, ekli bir T7 RNA polimeraz promotörüne sahip bir oligonükleotit primeri, 30 ila 50 yönünde hareket ederek RT etkisiyle uzatılır.

Bir RNAaz enzimi daha sonra RNA zincirini bozar ve ikinci bir primer cDNA molekülüne bağlanır ve RT çift sarmallı DNA molekülünü üretir (tekniğin son yinelemelerinde, DNA zincirinde ters transkripsiyon DNA polimerazı ve RNAaz aktivitesini birleştiren bir enzim kullanılmıştır – TMA tekniğinde olduğu gibi).

T7 polimeraz daha sonra çift sarmallı DNA’dan RNA transkriptleri üretir ve NASBA prosedürü için başka şablonlar olarak görev yapar. Amplikonların tespiti, streptavidin kaplı paramanyetik boncuklara bağlı bir oligonükleotit ve rutenyum etiketli bir prob ile hibridizasyon yoluyla gerçekleştirilir.

Hibritleştirilmiş amplikon-prob kompleksini taşıyan paramanyetik boncuklar, bir mıknatıs vasıtasıyla bir elektrotun yüzeyinde yakalanır. Bu elektrota uygulanan voltaj, bir elektrokimyasal ışıldama reaksiyonunu tetikler. Çok çeşitli hedefler için testler tanımlanmıştır ve son zamanlardaki bir gelişme, bu teknolojide HIV RNA’sının ‘gerçek zamanlı’ tespiti ve nicelleştirilmesine izin veren ‘moleküler işaretçilerin’ kullanılmasıdır.

Tel Yer Değiştirme Amplifikasyonu

İplik yer değiştirme amplifikasyonu (SDA), nükleik asit amplifikasyonu alanında karşılaştırmalı bir yenidir, ancak yaygın olarak kabul görmüştür. SDA yöntemi, DNA polimerazlarının, çift sarmallı bir DNA hedef molekülü içindeki tek sarmallı bir çentikte DNA sentezini başlatma yeteneğine dayanır.

Hedef DNA molekülünün ekstraksiyonu ve denatürasyonunun ardından, hedefe özel bir dizi içeren bir primer oligonükleotit ve bir kısıtlama enzimi tanıma bölgesi (genellikle BsopI) içeren bir dizi, tek sarmallı DNA hedef molekülüne bağlanır.

Bir DNA polimeraz enzimi daha sonra DNA molekülünü kopyalar. Ancak, bu uzama için kullanılan dNTP’ler, -tiyol ikamesi ile değiştirilir. Reaksiyona bir kısıtlama enzimi eklendiğinde, bu, DNA’yı BsopI tanıma bölgesinde kesmeye çalışır, ancak yeni sentezlenen zincir, kısıtlama enziminin yapamadığı, ikameli dCTP içerdiğinden, DNA sarmallarından yalnızca birini kesebilir.

Yeni sentezlenen DNA dizisi böylece yer değiştirir ve primer-DNA dupleksi, yeni bir DNA polimeraz güdümlü kopyalama turu için bir başlatıcı görevi görebilir. Serbest bırakılan kopyalar, reaksiyon için ek bir şablon görevi görebilir. Biriken ürün kemilüminesans yoluyla tespit edilebilir.

DNA polimeraz 1 görevi
DNA replikasyonu
Amplifikasyon Nedir
Rt-PCR Nedir
Replikasyon çatalı
Replikasyon orijini
Komplementer zincir nedir
Amplifikasyon yöntemleri

Sinyal Amplifikasyonu

Dallanmış Zincirli DNA

Nükleik asit saptama ve niceleme için bir “sinyal” amplifikasyon yönteminin bir örneği, ticari olarak temin edilebilen dallı zincirli DNA (bDNA) tahlilinde bulunur. Hepatit B virüs DNA’sını, hepatit C virüs RNA’sını ve insan immün yetmezlik RNA’sını saptamak ve ölçmek için üç ürün mevcuttur.

HIV RNA’sının saptanması için kullanılan yöntem, insan plazmasında HIV-1 RNA’nın doğrudan nicelenmesi için bir sandviç nükleik asit hibridizasyon prosedürüdür. HIV-1 önce santrifüjleme yoluyla plazmadan konsantre edilir. Daha sonra viryonlardan RNA’yı serbest bırakmak için tescilli bir nükleik asit ekstraksiyon prosedürü kullanılır.

RNA, bir dizi spesifik, sentetik oligonükleotid yakalama probu tarafından bir mikro kuyucukta yakalanır. Bir dizi hedef probun daha sonra hem viral RNA’ya hem de pre-amplifikatör problarına hibritleşmesine izin verilir. 17 ayrı yakalama genişletici içeren yakalama probları ve 81 ayrı hedef genişletici içeren hedef problar, viral RNA’nın pol geninin farklı bölgelerine bağlanır.

Amplifikatör probu, dallanmış bir DNA (bDNA) kompleksi oluşturarak ön amplifikatöre hibridize olur. Alkali fosfataz (AP) etiketli bir probun çoklu kopyaları daha sonra bu hareketsizleştirilmiş komplekse hibridize edilir. Tespit, kompleksin kemilüminesan bir substrat ile inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir.

Işık emisyonu, her numunede bulunan HIV-1 RNA miktarı ile doğrudan ilişkilidir ve sonuçlar, bir luminometre analizörü tarafından bağıl ışık birimleri (RLU’lar) olarak kaydedilir. Standart bir eğri, bilinen virüs konsantrasyonlarını içeren standartlardan gelen ışık emisyonu ile tanımlanır. Örneklerdeki HIV-1 RNA konsantrasyonları bu standart eğriden belirlenir.

Hibrit Yakalama

Ticari olarak temin edilebilen bir başka sinyal amplifikasyonu, bDNA yönteminden daha sınırlı hassasiyet sunar. Hibrit yakalama yöntemi, hedef DNA’yı serbest bırakmak için numunenin bozulmasını içerir. DNA daha sonra solüsyondaki spesifik RNA probları ile birleştirilir ve DNA-RNA hibritleri, DNA-RNA hibritlerine özgü monoklonal antikorlar kullanılarak bir mikrotitre plakası veya reaksiyon tüpü üzerinde yakalanır.

Yakalanan melezler, alkalin fosfataza konjuge edilmiş çoklu antikorlar kullanılarak saptanır. Bağlı alkalin fosfataz, bir dioekstan substrat ile kemilüminesan bir reaksiyonla tespit edilir.

Prob Amplifikasyonu

Ligaz Zincir Reaksiyonu

Ligaz zincir reaksiyonu (LCR), iki tamamlayıcı oligonükleotit prob dizisinin bir hedef DNA’ya bağlanmasını içerir (nükleik asidin viriondan ekstraksiyonu ve DNA’nın denatürasyonunun ardından). Hedef moleküle hibridize edildikten sonra iki çift tamamlayıcı sondayı birleştirmek için bir DNA ligaz enzimi kullanılır.

Reaksiyon, DNA zincirlerini ayırmak için ısıtılır ve iki tek sarmallı DNA dizisi, daha fazla prob bağlanması için şablonlar oluşturur. Yöntem, prob duplekslerinin kör uç ligasyonu nedeniyle yüksek arka plan ile bir şekilde sınırlıdır ve spesifik olmayan prob bağlanmasını azaltmak için hibridizasyon koşullarının oldukça katı olması gerekir.

Yine de teknik, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoea, mikobakteriler ve Borrelia spp içerir.

Ancak son zamanlarda, bu teknolojinin ticari sağlayıcıları, mikrobiyal hedeflerin saptanmasına yönelik bir PCR yaklaşımı lehine prosedürü terk etmeye başlamış gibi görünmektedir.

Dizi Analizi

Bir virüsün nükleik asit dizisinin belirlenmesi, klinik virolojide önemli pratik uygulamalara sahiptir. Virüsün hücre kültürü izolasyonunun kullanımı, daha hızlı virüs tanımlama yöntemleri (viral antijenlerin doğrudan tespiti veya viral nükleik asitlerin tespiti gibi) lehine azaldığından, dolaşımdaki virüsle ilgili epidemiyolojik bilgi miktarında bir azalma olmuştur. 

The post Dallanmış Zincirli DNA – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

Sonda molekülünün DNA olduğu ve hedef molekülün ribozomal RNA’nın tamamlayıcı bir zinciri olduğu ticari olarak temin edilebilen kitler popülerdir çünkü bir mikrobiyal hücre birkaç bin ribozomal RNA dizisine sahiptir, ancak DNA hedeflerinin yalnızca bir veya iki kopyasına sahiptir.

Sonuç olarak, RNA’ya yönelik bu problar, bir numunedeki düşük sayıdaki mikroorganizmayı saptamak için DNA’ya yönelik problara göre çok daha hassastır.

Prob hibridizasyon deneyleri, çok çeşitli bakteri, mantar, virüs ve protozoanın kimliğini doğrulamak için kullanılır. Bir zamanlar cinsel yolla bulaşan bakteriyel patojenleri, Chlamydia trachomatis ve Neisseria gonorrhoeae’yi doğrudan klinik örneklerde saptamak için yaygın olarak kullanılmalarına rağmen, daha hassas amplifikasyon testleri bunun yerine popülerlik kazanmıştır.

Amplifikasyon Tahlilleri

Çoğunlukla, klinik bir örnekte, bir prob tarafından tespit edilemeyecek kadar az bakteri bulunabilir. Bu problemin üstesinden gelmek için, amplifikasyon teknikleri olarak adlandırılan çeşitli yöntemler geliştirilmiştir.

Bunlardan en popüler olanı (Dr. Kary Mullis’in Nobel ödülünü kazandığı) polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR olarak adlandırılır. Bu yöntemde örnek, bakteriyel DNA ipliklerini ayırmak için ısıtılır, karışıma bilinen bakteri primerleri eklenir ve bilinmeyen tek iplikli DNA ile eşleşirlerse onunla birleştirilir.

Primerler, orijinal DNA ipliklerinden daha kısa diziler olduğundan, nükleotidler ve ısıya dayanıklı bir Taq polimeraz enzimi (orijinal olarak Wyoming’in Yellowstone Milli Parkı’ndaki bir kaplıcada yaşayan bir bakteriden izole edilmiştir) oluşumunu tamamlamak için karışıma eklenir.

Hedef amplifikasyon nedir
Hedef amplifikasyon yöntemleri
Hedef amplifikasyon yöntemleri nelerdir
Sinyal amplifikasyon yöntemleri
Amplifikasyon yöntemleri
Hedef amplifikasyon yöntemleri nedir
Sinyal amplifikasyon nedir
Amplifikasyon yöntemleri nelerdir

Bir amplikon olarak adlandırılan yeni çift sarmallı DNA, yeniden ayrılır, yeni primerler ile tavlanır ve polimeraz enzimi varlığında nükleotidlerle genişletilir. Her bir PCR adımı, ısı döngüleyici olarak bilinen bir cihaz tarafından otomatik olarak kontrol edilen farklı bir sıcaklıkta gerçekleştirilir.

Döngü, 40 döngüye kadar devam eder, bu sırada orijinal DNA dizileri bir milyar kat arttırılır veya çoğaltılır ve bu nedenle birçok kopya tespit için kullanılabilir. Kemilüminesan veya EIA tipi renkli sinyal sağlayan haberci moleküller ile etiketlenmiş problar, amplikon tespiti için popüler yöntemlerdir. PCR reaksiyonundaki adımları göstermektedir.

Klinik örneklerde mikroorganizmaların hızlı tespiti için başka nükleik asit amplifikasyon tahlilleri geliştirilmiştir, ancak prensipleri PCR’ninkine benzer.

Amplifikasyon reaksiyonunu başlatmak için uygun primer sekansı mevcut olduğu sürece, herhangi bir enfeksiyöz ajanı tespit etmek için bir amplifikasyon testi geliştirilebilir.

Bu testler çok hassas olduğundan, klinik örneklerin amplifiye edilebilecek ve yanlış pozitif reaksiyonlarla sonuçlanabilecek yabancı DNA ile kontamine olmasını önlemek için laboratuvarda büyük özen gösterilmelidir.

Klinik mikrobiyoloji laboratuvarında antijen saptama, prob ve amplifikasyon testlerinin kullanımı Bölümler VIII, X ve XI’de daha ayrıntılı olarak tartışılmaktadır.

Sorular

1. Pek çok klinik mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılan iki ana kültür dışı teknoloji türü nelerdir?
2. Enfeksiyöz bir hastalığın laboratuvarda teşhisi için kültür dışı yöntemlerin kültür prosedürlerine göre üç avantajını listeleyin.
3. Üç tip immunoassay adlandırın.
4. Direkt immunoassay testinin dolaylı testten farkı nedir?
5. “işaretleyici” molekül nedir?
6. İki ana nükleik asit saptama yöntemini adlandırın.
7. Nükleik asit amplifikasyon testleri, nükleik asit prob testlerinden neden daha hassastır?
8.PCR testi nedir? Her adım öncesindeki inkübasyon sıcaklığı nedir?
9. Taq polimerazın hangi önemli özelliği PCR reaksiyonunda kullanımına izin verdi?
10. Primer, amplikon ve termal döngüleyiciyi kısaca tanımlayın.

Solunum Yolu Mikrobiyolojisi

Stafilokok

Stafilokoklar çevremizde ve vücudumuzun normal florasında her yerde bulunur. Ön burunlar ve faringeal yüzeyler dahil olmak üzere özellikle ciltte ve üst solunum yolunda sayısızdırlar.

Bazıları da bulaşıcı insan hastalıkları ile ilişkilidir. Stafilokoklar, karakteristik olarak üzüm gibi düzensiz kümeler halinde düzenlenmiş gram pozitif koklardır. Çoğu besleyici ortamda iyi büyüyen dayanıklı, fakültatif anaerobik organizmalardır.

Klinik olarak önemli üç ana tür vardır: Staphylococcus epider- midis, Staphylococcus saprophyticus ve Staphylococcus aureus. S. epidermidis, adından da anlaşılacağı gibi, cilt ve mukoza zarları dahil olmak üzere insan yüzey dokularında en sık yaşayan canlıdır.

Genellikle patojenik değildir, ancak örneğin kalp cerrahisi hastalarında veya kalıcı intravenöz kateterleri olanlarda yüzey bariyerlerini geçmek için alışılmadık bir fırsata sahipse ciddi enfeksiyonlara neden olabilir. S. saprophyticus, yaklaşık 16-25 yaşındaki genç kadınlarda akut idrar yolu enfeksiyonlarında rol oynamaktadır.

Normal flora arasında bulunmamıştır ve diğer enfeksiyon türlerine neden olduğu henüz bilinmemektedir. Tamlık için bu alıştırmaya dahil edilmiştir. S. epidermidis gibi, S. aureus genellikle sağlıklı kişilerin normal florasında bulunur, ancak bunun tersine, çoğu stafilokok hastalığına bu türün suşları neden olur.

S. aureus suşları, enfekte konağın hücreleri üzerinde zararlı etkiler yaratabilen bir dizi toksin ve enzim üretir. Hemolizinleri kırmızı kan hücrelerini yok edebilir. Enzim koagülaz plazmayı koagüle eder, ancak bunun stafilokok enfeksiyonundaki kesin rolü henüz bilinmemektedir.

Lökosidin, lökositleri yok eden stafilokokal bir toksindir. Hyaluronidaz, bağ dokusunun yapısal bir bileşeni olan bir substrata etki eden bir enzimdir. Lokal enfeksiyon alanındaki aktivitesi dokuyu parçalar ve stafilokokların daha derinlemesine nüfuz etmesine izin verir; bu nedenle “yayılma faktörü” olarak adlandırılır. (Bazı streptokoklar ayrıca hyaluronidaz üretir.)

Stafilokinaz, fibrin pıhtılarını çözerek, aksi takdirde vücudun lifli reaksiyonları tarafından duvarla kaplanacak olan organizmaların istilasını artırabilir.

Bir enterotoksin, bazı S. aureus suşları tarafından detaylandırılmıştır. Bunlar kontamine gıdalarda çoğalıyorsa, ürettikleri enterotoksin şiddetli gastroenterit veya stafilokokal gıda zehirlenmesinden sorumlu olabilir.

Bazı suşlar, TSST-1 olarak adlandırılan bir toksini ayrıntılandırarak toksik şok sendromu (TSS) üretir. Bu hastalık, esas olarak yüksek emici tampon kullanan adet gören kadınlarda görülür.

The post Amplifikasyon Tahlilleri – Laboratuvar Ödevleri –Tez danışmanlığı – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Elektrik Mühendisliği Ödev Yaptırma – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).