CZE’de proteinler, elektroforetik hareketliliklerindeki farklılıklara göre birbirinden ayrılır. Elektroforetik hareketlilik, bir proteinin moleküler yükünün ve hidrodinamik boyutunun bir fonksiyonudur. Belirli bir ortamda, elektroforetik hareketlilik, izoelektrik noktaya benzer şekilde proteinin kendine özgü bir özelliğidir.

Bu nedenle hareketlilik, proteinleri birbirinden ayırmak için kullanılabilir. Bu, nihai ürün ve ambalaj etiketlemesi için basit bir kimlik testi olarak CZE’yi kullanmanın temelidir. Örnek olarak, altı rMAb, bir rFab ve bir rF (abu) 2’nin CZE profilleri Şekil 9’da gösterilmektedir. Burada kullanılan proteinler, 7.5 ila 9.3 arasında değişen pI değerleri açısından benzerdir.

Ek olarak, rMAb’ler arasındaki amino asit sekansı homolojisi, rMAb 5 ve rMAb 5u arasında% 99 homoloji ile% 90’dan fazladır. Bu terapötik proteinlerin profilleri, protein yükü varyantları ile ilgili birçok pikin, bir genel koşul altında 15 dakikadan daha kısa bir sürede çözüldüğünü gösterir. Her molekül için ana pikin göç zamanlarının birbirinden açıkça farklı olduğuna dikkat etmek önemlidir. Ma ve Mire-Sluis’in belirttiği gibi, 40 bu benzersiz geçiş süresi, bir kimlik testi için gereken özgüllüğü sağlar.

CZE’nin yük heterojenliğini izleme potansiyeli, rMAb numunelerinin profillerinde gözlenen çeşitli zirvelerin daha fazla araştırılmasıyla incelenmiştir. RMAb 1 elektroferogramının genişletilmiş bir görünümü Şekil 10A’da gösterilmektedir. Karboksipeptidaz B sindirimi ile tedavi, üç ana zirvenin, ağır zincir üzerinde sıfır, bir ve iki C-terminal lizin41 kalıntısına sahip antikor formlarına karşılık geldiğini doğruladı.

Kullanılan CZE koşulları altında, antikor pozitif olarak yüklenir ve detektörü geçen katoda doğru hareket eder. Antikorun 2-Lys formu en yüksek sayıda net pozitif yüke sahiptir ve bu nedenle yüksek elektroforetik hareketliliği nedeniyle en hızlı şekilde yer değiştirir. Sonuç olarak, antikorun 1-Lys ve 0-Lys formları, azalan hareketlilik sırasına göre yer değiştirir. Ek olarak, daha düşük elektroforetik hareketliliğe sahip antikorun asidik varyantlarının 0-Lys zirvesinden sonra göç ettiği gözlendi.

CZE, yük heterojenliğinin analizi için potansiyel bir tamamlayıcı araç olarak yaygın olarak kullanılan iyon değişim kromatografisi (IEC) tekniği ile karşılaştırılır. RMAb 1’in IEC analizinden elde edilen tipik bir kromatogram Şekil 10B’de gösterilmektedir. CZE’ye benzer şekilde, üç ana tür, ağır zincirde sıfır, bir ve iki C-terminal tortusu olan antikor formlarıydı. Bu durumda, elüsyon sırası, ilk olarak 0-Lys türlerinin ayrıştırıldığı CZE’dekine zıttı çünkü bu üç form arasında en asidik türdü; bu nedenle, katyon değişim kolonunun negatif yüzeyi ile en zayıf etkileşime sahipti.

Asidik varyantlar, 0-Lys pikinden önce yıkanarak da gözlendi. Rekombinant antikorların yük heterojenliğini izlemek için CZE yönteminin avantajları, hızlı analiz sürelerinde birden fazla ürünü analiz etmek için bir jenerik CZE koşulunu kullanma olasılığını içerir. Bu, hücre kültürü sırasında üretilen rMAb numunelerinin yüksek verimli analizini ve proses geliştirmenin saflaştırma çabalarını karşılamak için önemli bir özelliktir.

CZE, terapötik rMAb’lerin formülasyon geliştirilmesinde ve stabilitesinin izlenmesinde pratik bir teknik olarak da kullanılabilir. Tahlilin, çeşitli zorunlu bozunma koşullarına maruz kalan rMAb numunelerindeki değişiklikleri tespit etme yeteneği değerlendirildi. Çeşitli koşullar altında zorla bozulmuş örneklerin temsili CZE profilleri Şekil 11’de gösterilmektedir. Bu sonuçlar, testin bir kontrol rMAb örneğinin yük heterojenliği profilindeki değişiklikleri saptayabildiğini gösterdi.

Amino asitlerde izoelektrik nokta nedir
Glisin titrasyon eğrisi
Biüret deneyi raporu
İzoelektrik nokta hesaplama
Biüret Deneyi prensibi
Ksantoprotein deneyi
Ninhidrin reaksiyonu
Amino asitlerin titrasyon eğrisi

KAPILLAR ISOELEKTRİK ODAKLAMA

Terapötik proteinlerin proses gelişimi ve analitik karakterizasyonu, bu biyoteknoloji ürünleriyle ilişkili karmaşıklık ve heterojenlik nedeniyle birçok zorluk ortaya çıkarmaktadır. Daha önce, terapötik rMAb’ler kalitatif, emek yoğun jel IEF yöntemleri kullanılarak karakterize ediliyordu. Kapiler izoelektrik odaklama (cIEF), geleneksel jel IEF’in yüksek çözme gücünü CE enstrümantasyonunun avantajı ile birleştirir.

Proteinler, kılcal damarlara bir elektrik alanı uygulandığında taşıyıcı amfoliitler tarafından oluşturulan bir pH gradyanında izoelektrik noktalarına (pI) göre ayrılır. Bir proteinin pl’si (proteinin net sıfır yüke sahip olduğu pH), amino asit bileşimi, dizisi, 3-D yapısı, çeviri sonrası modifikasyonları vb. İle tanımlanır.

CIEF’te genellikle LIF ve UV gibi çevrimiçi konsantrasyona duyarlı dedektörler kullanılır. Çoğu ticari CE cihazındaki dedektör, kılcalın çıkışına doğru sabit bir noktadadır. Sonuç olarak, kılcal damar içindeki odaklanmış protein bölgeleri, detektör penceresinden geçmek için harekete geçirilmelidir.

İsoelektrik Noktasının Belirlenmesi

CIEF’in önemli bir uygulaması, bir proteinin izoelektrik noktasının belirlenmesidir. Klasik IEF’de olduğu gibi, cIEF yöntemi, pI’leri bilinen standart işaretleyicilerle kalibrasyonu içerir. CIEF’de yaygın olarak kullanılan belirteçler, geleneksel protein standartlarına kıyasla büyük stabilite ve algılama hassasiyeti olan sentetik düşük moleküler ağırlıklı bileşiklerdir.

Bilinmeyen izoelektrik noktası ve pl markörleri olan bir rMAb’nin tipik cIEF profilleri Şekil 12’de gösterilmektedir. Ağır zincirlerin karboksil terminalinde sıfır, bir ve iki lizin kalıntısına sahip üç antikor formunu temsil eden üç ana tepe gözlendi.

PI’ye karşı mobilizasyon süresinin bir grafiği, tanımlanmış bir pH aralığında doğrusallık göstermelidir. Böyle bir kalibrasyon grafiği Şekil 13’te gösterilmektedir ve görünen pl değerleri, pI’lerinin belirlenmesi için sırasıyla 0-Lys, 1-Lys ve 2-Lys antikor formları için 9.0, 9.1 ve 9.2 olarak hesaplanmıştır. bir rMAb’nin bileşenleri.

RMAb Şarj Heterojenliğinin İzlenmesi

CIEF’in genel rMAb yük dağılımını değerlendirme potansiyeli Şekil 13’te gösterilmektedir. Elektroferogram, pI markörleri 7.9 ve 5.3 arasındaki antikorun çeşitli izoformlarını gösterir. Antikorun ana zirvesi veya 0-Lys formu B27 dakikada görünür. Ağır zincirde bir ve iki C-terminal Lys kalıntısına sahip daha temel türler, birbirlerinden ve ana pikten temelde ayrıştırılır.

Sonuçları, Şekil 10’da gösterildiği gibi CZE ve IEC tarafından elde edilenlere benzerdir. Öte yandan, asidik varyantlar, Şekil 13’te gösterildiği gibi, cIEF tarafından 0-Lys formundan daha iyi ayrılır. Şekil 10. Birlikte ele alındığında bu veriler, terapötik proteinlerin yük heterojenliğini izlemek için IEC ile tamamlayıcı bir teknik olarak cIEF’i kullanmanın uygulanabilirliğini gösterir.

The post İsoelektrik Noktasının Belirlenmesi – Farmasötik Analiz İçin Kapiller Elektroforez Yöntemleri – Ayırma Teknolojisi – FARMASÖTİK ANALİZ – Kimya Mühendisliği – Ayırma Teknolojisi Ödevleri – Kimya Mühendisliği Ödev Yaptırma – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

LC, nihai ürünün saflaştırılmasında yaygın olarak kullanılır, ancak tek bazlı çözünürlüğe ulaşmanın zorluğu nedeniyle ürünün saflığını analitik olarak test etmek için kullanılamaz. Benzer şekilde, CZE ve MEKC yöntemleri yalnızca 10 bazdan daha kısa olan nükleositleri, nükleotidleri ve tek sarmallı oligomerleri çözebilir. Daha büyük ODN’ler neredeyse eşit yük-kütle oranlarına sahiptir ve bu nedenle CGE’nin eleme matrisini gerektirir. CGE, nihai ürünlerin değerlendirilmesi için gereken en iyi seçiciliği sunar ve bu nedenle kimyasal olarak sentezlenmiş ODN’lerin saflık tayini için analitik bir araç olarak düşünülmektedir.

Poliakrilamid jelleri ile yüksek performanslı CGE, 8 dakikadan daha kısa bir sürede pikomol miktarlarında ODN’lerin (polideoksiadenilik asitler, (dA) 40260) temel ayrılmasını sağladı. Analitik ayırmaların yanı sıra, sentezlenen ODN’leri hızla karakterize etmek ve saflaştırılmış fraksiyonları izole etmek ve toplamak için de kullanılmıştır.

CGE, fosforotiyoatların (SODN’ler) arıza dizilerinin 65 dakika içinde 1’den 50 baza hızlı bir şekilde ayrılmasına izin vererek yüksek çözme gücünü kanıtladı. Kantitatif CGE, intravitreal bir formülasyonda 21-mer fosforotioat ODN, ISIS 2922 ve bozunma ürünlerinin doğru kantitasyonu için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, yöntem ilacı tek başına ölçmek için uygundu ve bozunma ürünlerini ölçmek için yeterince seçici değildi. CGE, antisens ODN’lerin stabilite ölçümleri için başarıyla kullanıldı.

800 V / cm’ye kadar yüksek voltajlarda izoelektrik tamponlarda (histidin) CGE saflık değerlendirmelerinin LC.290,291 CGE’den daha doğru olduğu kanıtlanmıştır, 18 mer ODN’nin başarısız ve kesilmiş dizilerden (10- ila 17-mer ) 425 dakika içinde, ürünün doğru saflık değerlendirmesi% 65 iken, LC sonuçlarında, başarısız ve kesilmiş dizilerin zayıf çözünürlüğü nedeniyle saflığın% W95 olduğu düşünülmüştür.

CE’de izoelektrik tamponların kullanılması, minimum difüzyonla çalışan tepe yayılımı nedeniyle yüksek çözünürlüklü hızlı ayırmalara izin veren çok yüksek voltaj gradyanlarının (nispeten yüksek delikli kapilerde 1000 V / cm’ye kadar, örneğin 752100 mm’ye kadar) uygulanmasına izin verir. CGE başarısız ve kesilmiş dizilerle kontamine olmuş 18-mer ODN’nin ayrılması için sabit bir pH gradyanına karşı denendi. Benzersiz analit çözünürlüğü 12 dakika içinde elde edildi.

Micro-Gel gibi dolaşık bir polimer jel matrisini kullanan CGE, sentezlenmiş antisens ODN’lerin ve DNA analoglarının (özellikle SODN’lerin) saflığının belirlenmesine izin verdi ve yöntemin, üstün çözme gücü nedeniyle LC’ye göre avantajlı olduğu bulundu.

Amino asitlerde izoelektrik nokta nedir
İzoelektrik nokta nedir
İzoelektrik nokta nasıl ölçülür
İzoelektrik nokta hesaplama
Zwitter iyon Nedir
Proteinlerde izoelektrik nokta
İzoelektrik nedir
İzoelektrik nokta ne işe yarar

Kapiler kapiler içinde eleme ajanı olarak yüksek konsantrasyonda düşük viskozite dereceli HEC içeren dolaşık bir polimer çözelti sistemi, uzunluğu 12-24-mer arasında değişen kısa model homo-oligomerik deoksinükleotitlerin ayrılmasına izin verdi.  Bu sistem iyi bir performans gösterdi. P (dA) 12218 ve p (dA) 19224’ün, bir MEKC sistemine kıyasla tek bir temel birim farkıyla ayrılması, ki bu, ODN’leri yalnızca 13 baza kadar ayırabilir.

Sonraki bir çalışmada, benzer bir dolaşık polimer sistemi, seçilen sentetik ODN’lerin saflığını kontrol etmek için verimli bir şekilde uygulandı ve sonuçlar,% 54,8 ile% 96,5 arasında saflık aralıkları gösterdi; bu, sentezden sonra kullanılan ters fazlı LC saflaştırmasının bazen yetersiz olduğunu gösterir.

ODN’lerin hem bir “çevrim dışı” analizde (enzimatik reaksiyon, ürün ayırma adımından fiziksel olarak ayrılmış) hem de “sıralı” analiz formatında (enzimatik reaksiyon ve ürün ayırma adımları entegre edilmiştir) enzimatik bozunması ayrıca incelendi. ” Çevrimdışı ” analiz, güzel bozulma modelleri gösterdi ve yarı ömürlerin hesaplanmasına izin verdi ve ” sıralı ” analiz için, geçici etkileşim EMMA’da ” fiş-fiş ” reaksiyonu araştırıldı ve Elde edilen bozunma modelleri çevrim dışı inkübasyon ve ayırma ile tutarlıydı.

Benzer dolaşık polimer sistemine sahip CPSE, kısa model homo-oligomerik deoksinükleotidlerin (dA21 ve pdA21) fosfodiesteraz I ile enzimatik bozunmasının hat içi bağlanmasının (EMMA) uygulanabilirliğini göstermek için de kullanıldı. Bu otomatik prosedür, daha büyük kütüphaneleri taramak için olasılıkları açtı saflaştırılmış nükleazlara karşı stabilite için sentetik antisens ODN’lerin. HBL 100ras hücrelerinde bulunan nükleazlara karşı antisens ODN’lerin hücre içi stabilitesini kontrol etmek için, CITP ve CPSE’nin çevrimiçi kombinasyonu, bununla birlikte, sağlam hücrelerdeki ODN’leri tespit edememekle birlikte kullanıldı.

Dinamik eleme CE ile 20 mer ODN’nin mutlak konsantrasyonu ve saflığının belirlenmesi, dahili standart olarak bir deoksinükleosit trifosfat kullanılarak gerçekleştirildi. Benzer şekilde, LC ile saflaştırılan başka bir DNA analogu olan kimerik ODN’nin saflığı, dinamik polimer eleme elektroforezi ile tahmin edildi.

Sonuçlar, geniş bir dinamik aralıkta yüklemelere izin vermeyen ve bu nedenle çeşitli LC fraksiyonlarının nispi safsızlık içeriğini değerlendirmek için kullanılamayan PAGE analizi ile elde edilenlerle karşılaştırıldı. 20 bazın altındaki ODN’lerin CGE analizi için çeşitli polimerler araştırılmış ve% 30 dekstranın, diğer polimerlere kıyasla 35 dakika içinde ODN’leri p (dT) 11220’yi temel olarak ayırarak etkili olduğu bulunmuştur ve bu yöntem, sentetik ODN’lerdeki safsızlıkların analizidir.

Temelde dT12218 ve dT19224 olmak üzere ODN’lerin mükemmel CGE ayrımları, Pluronics F127’nin misel sıvı kristal% 18230 solüsyonlarında elde edildi. Pluronics F127, yüksüz, çapraz bağlı olmayan bir [EO] 106 [PO] 70 [EO] 106 triblok kopolimerdir, özellikle astarların boyut aralığındaki ODN’lerin yüksek performanslı CGE ayrımı için çok uygun, kullanışlı ve kolayca değiştirilebilir bir ortamdır. DNA dizileme ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve oligonükleotid terapötikleri. 304 50 ° C’de% 30 formamid içeren 100 mM Tris-borat tamponu pH 9.0’da% 13 PEG dolgulu kapilerler, farklı uzunluktaki antisens fosforotiyoatları başarıyla çözdü.

Bir CE-SDS jel olmayan eleme sistemi geliştirilmiş ve rMAb’lerin 5-karboksitetrametilrhodamin, süksinimidil ester (5-TAMRA.SE) ile önceden türevlendirilmesi ile terapötik rekombinant monoklonal antikorların (rMAb’ler) analizi için geliştirilmiş ve doğrulanmıştır. LIF tespiti kullanılarak, ürünle ilgili varyantların boyuta dayalı ayrılması ve ürün dışı safsızlıklar (aynı tesiste üretilen diğer ürünlerden veya konak hücre proteinlerinden kaynaklanan çapraz kontaminasyondan kaynaklanan)% 0,05 seviyesinde mümkün olmuştur.

Kılcal Elektrokromatografi

CEC, LC’nin sabit fazını, benzersiz seçiciliklerin elde edilebildiği CE’nin elektrikle çalışan mobil faz nakli ile birleştiren bir hibrit ayırma tekniğidir. Solütler, her iki faz arasında bölünmelerine ve yüklendiklerinde elektroforetik hareketliliklerine göre ayrılır.

The post İzoelektrik – Farmasötik Analiz İçin Kapiller Elektroforez Yöntemleri – Ayırma Teknolojisi – FARMASÖTİK ANALİZ – Kimya Mühendisliği – Ayırma Teknolojisi Ödevleri – Kimya Mühendisliği Ödev Yaptırma – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).