Bu, şu anda kullanımda olan en popüler serolojik testtir. Metodolojide birçok varyasyon vardır, ancak hepsi antijenin genellikle bir polistiren veya polivinil plaka veya boncuk olan katı bir faza bağlanmasını içerir. Hastanın serumu eklenir ve antikorun katı fazda antijene bağlanmasına izin vermek için uygun bir süre sonra, spesifik olmayan bağlanmış materyal ve fazla serum yıkanarak çıkarılır.

Daha sonra bir enzimle (konjugat) konjugasyonla etiketlenmiş bir anti-insan immünoglobulin eklenir. Konjugat, antijen-antikor kompleksindeki antikora bağlanır. Fazla konjugat daha sonra yıkanır ve bağlı etiketli anti-insan immünoglobulinin varlığı, etiketleme enzimi için uygun bir substratın eklenmesiyle saptanır.

Uygun reaksiyonlar meydana gelirse, substrat ışığı emen bir ürüne dönüştürülür ve renkli görünür. Antikor yokluğunda renk üretilmez. Rengin yoğunluğu doğrudan antijene bağlanan antikor miktarı ile ilgilidir.

Renk değişimi çıplak gözle ölçülebilir veya bir spektrofotometre ile okunarak reaksiyonun tam gücünü verir. Yaygın olarak kullanılan enzim substrat sistemleri yaban turpu peroksidaz (HRP) O-fenilen diamin (OPD) ve alkalin fosfataz ve p-nitrofenil fosfatazdır.

Testi antijenin saptanmasına uyarlamak için katı faz, saptanacak antijene özgü antikorla kaplanır. Daha sonra katı fazın yüzeyindeki herhangi bir antikor-antijen kompleksini tespit etmek için ikinci bir etiketli antikor eklenir. Reaksiyon sırasına bağlı olarak, ELISA’lar doğrudan, dolaylı, yakalama veya rekabetçi testlere ayrılır.

Şekil 20.4, bu testler arasındaki bazı farklılıkları açıklamaktadır. Testler, ikinci antikor olarak anti-insan IgM veya IgG immünoglobulinin kullanılıp kullanılmadığına bağlı olarak IgM veya IgG için spesifiktir. Ayrıntılı bir inceleme için okuyucu, Booth, 1983’e başvurur.

ELISA çok hassas bir tekniktir çünkü az miktarda enzim büyük miktarda substratı işleyebilir. Katı fazda antijen için rekabet eden yüksek seviyelerde spesifik IgG varlığında hatalı negatif IgM sonuçları meydana gelebilir. Bu, numunenin test edilmesinden önce IgG’nin çıkarılmasıyla önlenebilir.

IgM testinde spesifik olmayan reaksiyonlar, romatoid faktör (RF) varlığı nedeniyle de meydana gelebilir. IgM sınıfının RF faktörü, katı fazda antijene bağlandığında spesifik IgG molekülünün Fc bölgesindeki konfigürasyonel değişiklikler nedeniyle maruz kalan yeni antijenlere bağlanır.

Elisa testi
ELISA test
ELISA yöntemi
Serolojik testler
ELISA Çeşitleri
Seroloji testi nerede yapılır
Elisa testi nasıl yapılır
Seroloji Laboratuvarı

IgM RF, virüse özgü IgM’den ayırt edilemez, ancak RF, IgM için test edilmeden önce kümelenmiş IgG ile emilerek uzaklaştırılabilir. Hastanın serumundaki RF veya spesifik IgG’den etkilenmedikleri için IgM yakalama testleri tercih edilir. ELISA’lar objektif olma avantajına sahiptir, kolayca otomatikleştirilebilir ve büyük teknik uzmanlık gerektirmez.

Hızlı testlerdir ve çoğu test 2-3 saat içinde tamamlanabilir. Mikrobiyoloji laboratuvarlarının tümü olmasa da çoğu, HIV, viral hepatit, kızamıkçık, sitomegalovirüs, Epstein Barr virüsü, suçiçeği zoster virüsü, kızamık, kabakulak, toksoplazma, Chlamydia’nın taranması ve serolojik teşhisi için yaygın olarak kullanılan ELISA’ları gerçekleştirmek için donatılmıştır. 

Farklı ELISA Formatları

(a) Dolaylı ELISA:
1. Katı fazı viral antijenle kaplayın.
2. Hastanın serumu ile inkübe edin. Spesifik antikor mevcut
katı faza bağlı antijene bağlanır.
3. Enzim etiketli anti-IgG veya -IgM ekleyin.
4. Substrat ekleyin; reaksiyon pozitifse renk değişimi.
(b) ELISA’yı Yakala:
1. Katı fazı anti-IgG veya IgM ile kaplayın.
2. Hastanın serumu ile inkübe edin. Mevcut tüm IgG veya IgM
katı fazda yakalanır.
3. Antijen ekleyin; bu, yakalanan herhangi bir spesifik antikora bağlanacaktır.
4. Enzim etiketli antiviral IgG ekleyin.
5. Alt tabaka ekleyin; reaksiyon pozitifse renk değişimi. (c) Rekabetçi ELISA:

1. Katı fazı antijenle kaplayın.
2. Hastanın serumunu ve enzim etiketli spesifik antikoru ekleyin. Spesifik antikor, katı faza bağlanmak için konjugat ile rekabet eder.
3. Alt tabaka ekleyin. Pozitif reaksiyon, renksiz olarak gösterilmez.
(a), konjugat spesifik antikor tarafından bloke edildiğinden. Enzim etiketli antikor bloke edilmediğinden negatif reaksiyon (b) ‘de renkle gösterilir.

İmmünofloresan (IF)

Antikor tespiti için indirekt IF’de, viral olarak enfekte olmuş hücreler veya bakteriyel antijen, Teflon kaplı cam slaytlar üzerindeki kuyucuklara sabitlenir, hastanın serumu eklenir ve anti-insan immünoglobülin ile etiketlenmiş antijen-antikor reaksiyonu tespit edilir. (floresein boyası – floresein izotiyonat).

Reaksiyon bir floresan ışık mikroskobu altında okunur, pozitif reaksiyonlar tipik elma yeşili floresan ile gösterilir. Sitomegalovirüs, Epstein – Barr ve varicella zoster virüslerine karşı IgM ve IgG antikorlarının tespiti için Dolaylı IF testleri yıllardır kullanılmaktadır.

IgM sınıfı virüse özgü olmayan antikorun bağlanabileceği, enfekte hücreler üzerindeki reseptörlerin ekspresyonuna bağlı yanlış pozitif reaksiyonlar bir sorundur. IF testleri ayrıca floresan mikroskobu gibi özel ekipman gerektirir ve okumada operatörün önyargısına tabidir. Bu nedenle, antikor tespiti için çoğunlukla ELISA’lar ile değiştirilmişlerdir.

Öte yandan, çeşitli viral antijenlere karşı kaliteli monoklonallerin mevcudiyeti, doğrudan IF’yi çeşitli dokularda ve örneklerde antijenin saptanması için tercih edilen yöntem haline getirmiştir. Enfekte olan materyal, aseton veya alkol yardımıyla bir cam slayta sabitlenir ve test edilen antijene yönelik floresein etiketli monoklonal antikor ile boyanır.

Direct IF, solunum sinsitik virüsü, influenza A ve B virüsleri, parainfluenza 1, 2 ve 3 virüsleri ve adenovirüsler için nazofarengeal aspiratlardan epitel hücrelerinin test edilmesiyle solunum virüslerinin hızlı teşhisi için yaygın olarak kullanılmaktadır.

Radyoimmunoassayler (RIA)

Bunlar ELISA’larla aynı ilkelere sahiptir. RIA testleri, enzim etiketi yerine radyoizotop etiketi kullanır. Radyo-etiketin kısa raf ömrü ve özel radyo-aktivite imha gereksinimleri nedeniyle, bunların yerini ELISA’lar almıştır.

Western blot (WB) veya line immunoassay (LIA)

Bu, mikroorganizmalara karşı antikorları nitroselüloz membranlara yapıştırılmış antijenlere bağlanmaları sayesinde saptamak ve karakterize etmek için oldukça spesifik ve hassas bir araç sağlar.

WB için, yarı saflaştırılmış viral veya bakteriyel proteinler, bir poliakrilamid jel üzerinde elektroforez ile ayrılır ve daha sonra elektroforik olarak bir nitroselüloz membrana aktarılır. LIA’da rekombinant moleküler tekniklerle üretilen veya yapay olarak sentezlenen (sentetik peptidler) viral antijenler doğrudan nitroselüloz membrana eklenir.

The post ELISA Tahlilleri – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).