Türevlendirme, kromatografiden önce veya sonra gerçekleştirilebilir.

Ön sütun türevlendirme

Ön kolon türevlendirmesinin avantajları, sadece örnek tespitinin geliştirilebilmesi değil, aynı zamanda bileşiklerin ekstraksiyonunun, saflaştırılmasının ve kromatografisinin modifiye edilebilmesidir. Ek olarak, çok çeşitli reaktifler mevcuttur.

Bununla birlikte, kolon öncesi türevlendirmenin dezavantajları, örneklerin türevlendirme prosedürü sırasında bozunması ve kimyasal reaksiyonların tamamlanmayarak kromatogramda sahte zirvelere yol açmasıdır.

Sütun sonrası türevlendirme

Ön kolon türevlendirmeden farklı olarak, kolon sonrası türevlendirme reaksiyonunun tamamlanmasına gerek yoktur, ancak reaksiyonun boyutu tekrarlanabilir olmalıdır. Reaktör tasarımının çok önemli bir faktör olmasına yol açan, bant yayılmasını sınırlandırma arzusuyla birleştiğinde bu gerekliliktir.

Üç reaktör tasarımı popülerdir, spesifik seçim reaksiyon hızına bağlıdır ve ideal olarak çok hızlı olmalıdır (<30 s). İlk tasarım, hem kolon eluent hem de reaktif ile basit bir T-bağlantı noktasıyla sağlanan basit bir bobinden oluşur ve 1 dakikadan daha kısa reaksiyonlar için idealdir.

5 dakikaya kadar küçük cam boncukların (<20 pm) paketlenmiş yataklarının reaksiyonları için kullanılır ve daha uzun reaksiyon süreleri için bant genişlemesini en aza indirmek için hava bölümlü akış sistemi gereklidir.

Tüm bu yöntemlerin numuneyi tahrip ettiği ve bu nedenle pik toplama gerekliyse bir tür eluent akışı bölme işleminin gerekli olduğu bilinmelidir. Sütun sonrası türetme yöntemlerinin bazı örnekleri bulunabilir.

HPLC
HPLC ve GC arasındaki Farklar
Türevlendirme nedir
HPLC dedektörleri
Gaz kromatografisi Dedektörleri
Hplc Nedir
DAD dedektör
HPLC ve GC karşılaştırma

Sütun yapımı

Çoğu HPLC kolonunda kullanılan 316 paslanmaz çelik dahil olmak üzere tüm metaller sonunda kimyasal korozyona uğrar ve özellikle halojenür iyonları HPLC sistemi kullanılmadığında tamamen çıkarılmalıdır. Tüm HPLC bileşenlerinin ya saf çözücüler içinde ya da organik çözücülerin sulu karışımları içinde depolanması iyi bir genel uygulamadır.

Düzensizlikler performans kaybına ve “kolondan kolona” zayıf tekrarlanabilirliğe neden olabileceğinden, tüm HPLC kolonlarının pürüzsüz bir iç yüzeye sahip olması çok önemli bir gerekliliktir.

En popüler kolon boyutları 150 mm X 4.6 mm I.D. tipik analitik uygulamalar için, hazırlayıcı ölçek ayırmaları için çok daha büyük kolon çapları mevcuttur. Daha yakın zamanlarda, analitik uygulamalar için daha küçük çaplı kolonlara büyük ilgi olmuştur, örn. mikro delik (0.5-1.0 rahibe kimliği); paketlenmiş kapiler (80-125 pm I.D.) ve açık tübüler kapiler (30-50 pm I.D.); bunlar Bölüm 10.9’da daha ayrıntılı olarak tartışılmaktadır.

Frits

Bir HPLC mikro partikül kolonunun giriş friti genellikle 2 pm gözeneklidir ve mikropartikülat maddenin toplanması için en sık görülen noktadır, bu da sonunda artan geri basınçlara neden olur.

Fritler nispeten ucuz olduğu için en iyi çözüm eski friti yenisiyle değiştirmektir. Alternatif olarak, fritler ultra sonikasyon veya güçlü asitlerle işlem kullanılarak temizlenebilir.

Çoğu üretici, her bir ucunda aynı fritlere sahip kolonlar tedarik eder ve bu nedenle, genellikle tavsiye edilmemesine rağmen, kolon ters çevirme, üst fritin dışarı atıldığı bir yöntem olabilir. Bu yöntem, kolonun iyi paketlenmiş olması ve orijinal üst uçta hiç boşluk hacmi olmaması koşuluyla iyi çalışır.

HPLC’de mikro sütunlar

HPLC’deki en hızlı ilerleyen alanlardan biri, mikrokolon teknolojisidir ve çok uzak olmayan bir gelecekte yapılacak gelişmeler, muhtemelen mikrokolon HPLC teknolojisinin daha genel kullanıma sunulmasıyla sonuçlanacaktır.

Mikrokolon teknolojisindeki araştırmalar, 1960’ların sonlarında Horvath ve Lipsky (1966) tarafından 1 m uzunluğunda ve sadece 0,5 mm çapında olan ve pellicular materyalden oluşan bir pakete sahip kolonlar kullanılarak başlatıldı. Daha sonraki gelişmeler, bunların yerine 4-5 mm iç çapa ve 15-30 cm uzunluğa sahip kolonların geçmesi ile sonuçlanmıştır.

Mikro sütunların geleneksel sütunlara göre kendine özgü avantajlara sahip olduğu ve bir dizi farklı grup tarafından yapılan son çalışmalar, geniş olarak üç farklı kategoriye ayrılabilen mikro sütunların daha da geliştirilmesine yol açmıştır: mikro delikli (veya küçük delikli) paketlenmiş sütunlar, açık boru şekilli kılcal sütunlar ve paketlenmiş kılcal sütunlar.

Microbore paketlenmiş kolonlar

Bu kolonlar, yaklaşık 1 mm’lik bir iç çapa sahip olmaları dışında normal HPLC kolonlarına benzer. Paketleme malzemeleri, normal bulamaç paketleme teknikleriyle paslanmaz çelik kolonlara paketlenmiş küçük çaplı partiküllerden (3-30 pm) oluşur.

Silika jel sabit faz ile paketlenmiş 1 m’lik kolonlar kullanılarak iç çapın kolon verimliliği üzerindeki etkisinin incelenmesi, en düşük plaka yüksekliği değerlerinin (H) yaklaşık 1.02 mm’lik bir iç çap ile elde edildiğini göstermiştir.

Partikül boyutlarının etkisi de incelendi ve sonuçlar, 20 pm’lik bir paketlemenin optimum azaltılmış plaka yüksekliği eğrisini ürettiğini, ancak hem 5 pm hem de 10 pm paketlemelerin daha yüksek kolon verimleri verdiğini gösterdi. çap ve partikül boyutu, yalnızca ekipmanlarının belirli sabit fazı ve ekstra kolon ölü hacmi için geçerli olabilir.

Mikro delikli kolonların numune kapasitesinin, azaltılmış kesit alanlarından dolayı geleneksel kolonlara kıyasla çok daha düşük olduğu da not edilmelidir.

Açık boru şeklindeki kılcal kolonlar

Açık boru şeklindeki kapiler (OTC) kolonlar, gaz kromatografisinde kullanılan kapiler kolonların analoglarıdır ve genellikle çok düşük iç çaplara (50 pm veya daha az) sahip cam kolonlardan oluşur. sütun duvarına eşit olarak dağılmıştır.

Teorik olarak, OTC kolonlarının performansının geleneksel dolgulu kolonların performansına uyması için, iç çapın 10-30 aralığında olması gerekir.

OTC sütunlarından ayrıştırılan zirveler çok düşük hacimlidir ve bu, geleneksel detektörlerdeki (5-10 ul) akış hücrelerinin hacimleri elüe edilen tepe hacimlerinden çok daha büyük olduğu için teknik zorluklar yaratabilir.

Bu tür dedektörler OTC kolonları ile kullanıldığında bant dağılımı sonuçlanabilir ve bu şekilde bu kolonların içsel avantajlarını geçersiz kılar. Bu nedenle, akış hücresi hacmi 0.01-1 pl aralığında olmalıdır.

Benzer şekilde, kılcal sistemlerde hem minimum ölü hacim hem de enjeksiyon hacminde özel ön konsantrasyon ve numune alma tekniklerinin geliştirilmesini gerektiren bir azalma için bir gereklilik vardır.

OTC kolonlarının diğer bir kısıtlaması, numunenin aşırı yüklenmesine neden olabilecek küçük iç çaplarıdır; sadece 10 ng’den az miktarlar kullanılmalıdır.

The post Türevlendirme – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).