İmmünoblotlama ile küçük beyin örneklerinde bir gün içinde hızlı tanı elde edilebilir. Poliakrilamid SDS jelleri üzerinde ayrılan ve elektroforetik olarak nitroselüloz membranlara aktarılan proteinaz k-sindirilmiş doku, prion-spesifik antiserum ile reaksiyona giren 16-31 kDa moleküler ağırlıklı üç veya dört bant verir. Boyutları ve yoğunluk oranları, vCJD’yi sCJD’den ayırt edebilir. Bunlar Alzheimer hastalığında bulunmaz ve normal PrPc, proteinaz K tarafından tamamen sindirilir.

Diğer dokularda veya vücut sıvılarında testler

Şimdiye kadar tartışılan tüm yöntemler beyin dokusu üzerinde gerçekleştirilir. Teşhis, daha erişilebilir malzeme üzerinde daha basit olacaktır. PrPc’ye karşı monoklonal antikor, beyin dışındaki numunelerde proteaza dirençli PrP’yi tespit ederek CJD’yi teşhis etmek için kullanılabilir.

CJD hastalarının idrarında SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve proteinaz K ile sindirilmiş ultrasantrifüj topaklarının immünoblotlanması ile PrPR’ler tespit edilmiştir. Ayrıca formalinle sabitlenmiş gömülü bademcikler ve lenf düğümlerinde, deparafinizasyon, formik asit tedavisi ve hidrolitik otoklavlamadan sonra, biotin-avidin konjugatı kullanılarak, ancak sadece vCJD hastalarında saptanabilir.

Nöronal yıkımın vekil belirteçleri için beyin omurilik sıvısındaki testler artık CJD tanısı için kabul edilen repertuarın bir parçasıdır. En yaygın olarak kullanılan, 30 kDa yüksek oranda korunmuş nöronal protein 14-3-3’ü saptamak için tavşan poliklonal antikoru kullanan bir immünoblotlama tahlilidir.

Bu proteinin BOS’ta ortaya çıkması, bazı Alzheimer vakaları da dahil olmak üzere diğer nörodejeneratif hastalıklarda ortaya çıkabileceğinden, test sadece %88-95 spesifiktir. vCJD’ye (%50) sCJD’den daha az duyarlıdır, ancak aksonal mikrotübüler fosfoprotein olan tau için ticari bir ELISA ile birlikte test edilmesi vCJD duyarlılığını %86’ya kadar artırabilir.

Southern blot
Western blot
Blotlama nedir
Northern Blot yöntemi
Blotlama teknikleri
Moleküler yöntemler
Agaroz jel elektroforezi
Stacking jel Nedir

Non-invaziv teknikler

Elektroensefalografi, spesifik olmasa da genellikle faydalı olarak kabul edilir. Periyodik keskin dalga kompleksleri ve dış uyaranlara veya ilaçlara tepki gösterme belirgin gözlemlerdir. Tercih edilen mevcut görüntüleme testi, sCJD hastalarında %100 duyarlı ve spesifik olduğu iddia edilen bir belirteç olan multifokal kortikal ve subkortikal hiperintensiteler veren difüzyon ağırlıklı manyetik rezonans görüntülemedir (MRI).

Sonuç olarak, prion hastalığının doğası, tanıya yönelik olağan yaklaşımları ciddi şekilde sınırlar ve tanı genellikle yavaştır, invazivdir ve sıklıkla sadece otopside elde edilir. Bununla birlikte, vCJD, daha hızlı ve daha az invaziv teknikler için acil bir ivme sağlamıştır. 14–3–3 protein için CSF’yi test etmek şu anda mevcut ‘altın standarttır’ ve MRG’deki gelişmeler, non-invaziv tanı olasılıklarını iyileştirmiştir.

Antiviral duyarlılık testleri

Antiviral duyarlılık testleri, birçok rutin viroloji laboratuvarında henüz düzenli olarak yapılmamaktadır. Testlerin gerçekleştirilmesi birkaç gün veya hafta sürer ve bu nedenle yalnızca, aksi takdirde çok ciddi klinik problemler için uzun terapiye ihtiyaç duyan hastalara fayda sağlayabilir.

Muhtemelen insan immün yetmezlik virüsü (HIV) antiviral direncini izlemek veya bu hastalarda dirençli Herpes grubu virüslerini tanımlamak için çok sayıda bağışıklığı baskılanmış hastayla ilgilenen laboratuvarlarda ortaya çıkmaları daha olasıdır.

Uygulamada, antiviral tedaviyi değiştirme kararları genellikle deneysel direnç kanıtlarına, yani klinik olarak yanıt vermemeye dayanır. Alternatif olarak, viral antijenin başarısızlığı veya kandaki nükleik asit seviyelerinin tedaviye yanıt olarak düşmemesi gibi vekil direnç sınırları ölçülür.

Gerçek duyarlılık tahlilleri iki kategoriye ayrılır: antiviralin virüs büyümesi üzerindeki etkisini in vitro olarak ölçen fenotipik; ve direnç sağlayan mutantların varlığını doğrudan tespit eden genotipiktir.

Fenotipik tahliller

Fenotipik testler, antiviral direncin kesin kanıtını sağlar. Kültür hücreleri üzerindeki virüs büyümesinin genel sitopatik etkisini (CPE) veya viral metabolizmanın belirli aşamalarını, yani, inhibe etmek için gereken antiviral konsantrasyonu ölçerler. DNA veya protein sentezidir.

Virüsün önce doku kültüründe yayılması gerekir; bu adım, daha sonra test edilen dirençli mutantların oranını değiştirerek sonucu karıştırabilen bir adımdır. Bu nedenle testler tercihen düşük geçişli izolatlar üzerinde yapılır. HIV sıklıkla periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC) bir lenfoblastoid hücre dizisi ile birlikte kültür yoluyla izole edilir, bu da ilave bir başka komplikasyondur.

Plak azaltma (PR) testleri

Hücre tek tabakaları, virüs hareketini sınırlayan koşullarda, yani katı bir agar veya selüloz kaplaması veya antiviral immünoglobulin içeren sıvı altında seyreltilmiş virüs ile tohumlandığında, her virüs plağı oluşturan birim (pfu) ayrı bir CPE plakı üretir.

Sabit titre edilmiş virüs miktarları (15-500 pfu) ile birlikte seri olarak seyreltilmiş antiviralin eklenmesi, %50 plak azalmasına (ID50) neden olan konsantrasyon olarak antiviral duyarlılığın ölçülmesini sağlar.

PR testleri sadece izolatın %20-25’inden fazlasını oluşturan dirençli suşları tespit eder. %90 plak azaltma eşiği kullanılarak daha düşük oranlar tespit edilebilir, ancak ID90 ölçümleri ID50’den daha az doğrudur.

PR tahlilleri nispeten ucuz rutin kültür teknikleri kullanır, ancak dezavantajlar, kullanılan reaktiflerin, ortam ve virüsün hacimleri ve hücre, virüs ve antiviral konsantrasyonları standardize etmek ve kopya kültürlerdeki plakları manuel olarak saymak için gereken süredir.

Genel test süresi en az 2 haftadır. Virüs:hücre oranı, oranlar sırasıyla çok düşük veya çok yüksek olduğunda hatalı olarak yüksek veya düşük duyarlılık tahminleri oluşturmaktan kaçınmak için optimize edilmelidir.

Ön Herpes simpleks (HSV) duyarlılık sonuçları, izolatların enfektivitelerinin titrasyonuna paralel olarak ön tarama yapılarak, kabul edilen direnç eşik konsantrasyonunun 1,5 katında asiklovirli ve asiklovirsiz seri viral dilüsyonların inkübasyonu ile 3 günde elde edilebilir.

PR testleri HSV, sitomegalovirüs (CMV) ve Varicella zoster (VZV) direncinin saptanması için altın standarttır. Kabul edilen direnç eşikleri belirlenmiştir: asiklovir için 2 mg/ml, foscarnet için 100 ml/ml ve gansiklovir için tedavi öncesine kıyasla ID50’de üç ila dört kat artış vardır.

Bununla birlikte, ilgili uzun prosedürler ve düşük izolasyon oranları, sıklıkla %30 kadar düşük, HIV PR tahlillerini daha hızlı genotipik tahlillere göre klinik olarak daha az kullanışlı hale getirir.

The post İmmünoblotlama – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).