VWF’nin Multimerik Analizi

1981 yılında, Ruggeri ve Zimmerman tarafından VWF:Ag multimerlerinin yüksek çözünürlüğü için indirgeyici olmayan bir SDS-jel elektroforezi rapor edilmiştir. Bu orijinal yöntem o zamandan beri başkaları tarafından değiştirildi ve geliştirildi, ancak yöntemin ilkesi aynı kaldı.

Modifikasyonlar, asıl yöntemdeki varyasyonları, proteinin ayrıldığı ortamın tipini, yarı otomasyonu ve farklı tipte antikorları ve multimer bantlarının görselleştirme yöntemlerini içerir.

Bu yöntemlerin tümü, yüksek ve/veya orta moleküler ağırlıklı multimerlerin kaybının olduğu varyant veya tip 2 VWD’de görülenler gibi VWF:Ag kalitatif anormalliklerinin tanımlanması için kullanılır.

Tip 2 VWD tanı ve sınıflandırmasında kullanılan VWF:Ag’nin kapsamlı multimer analizi için, hem plazma hem de trombosit VWF:Ag, %1.0-2.2 agaroz jel konsantrasyonlarında incelenmelidir. Burada açıklanan yöntem, Enayat ve Hill’in (1983) orijinal Ruggeri ve Zimmerman (1981) yönteminin modifikasyonudur.

Bu, süreksiz bir tampon tekniği kullanan bir SDS-agaroz jel elektroforezidir. Multimer bant görselleştirmesi, 125I etiketli bir mono- veya poliklonal anti-VWF antikoru kullanılarak otoradyografi ile yapılır. Agaroz jellerden multimer bantlarının farklı tipteki dolgu maddelerine aktarılmasından sonra bant görselleştirmesi için diğer radyoaktif olmayan yöntemler de mümkündür.

Alfa heliks yapısı
Protein katlanması PDF
Protein katlanması nedir
Proteinlerin katlanması
Proteinlerin alfa heliks yapısı
Globüler proteinler
Alfa heliks yapısı nedir
Yapısal proteinler

Jel Hazırlama

Jelleri hazırlamak için, bir cam plakayı kaplayan ve ikinci bir cam plakadan 1 mm kalınlığında U-şekilli bir plastik ayırıcı ile ayrılan bir jel bağ film parçasından (Flowgen) yapılmış bir sandviç seti kullanılır.

Çalışan jel (Agaroz Tip VII LGT; Sigma) cam plakaların arasına dökülür ve sertleştikten sonra üst cam plaka çıkarılır ve jelin tepesinden 3 cm’lik bir şerit kesilir ve yerine istifleme yapılır. %0,8 agarozdan oluşan jel (SeaKem HGT (P) Agarose, Flowgen Instruments Ltd).

Numune kuyuları istifleme jelinde kesilir. Test edilecek numuneler, moleküler migrasyonun izlenmesi için bromofenol mavi boya ve VWF moleküllerinin tam dağılımı için sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren ve tüm multimerlere negatif yük sağlayan bir tampon içinde 56°C’de 30 dakika süreyle inkübe edilir. 

Elektroforetik Koşullar

Her elektroforez aletinin bu yöntem için optimize edilmesi gerekir, ancak genel olarak, numunelerin kuyulardan istifleme jeline hareket etmesi için elektroforez başlangıçta 2 mA/cm hızla gerçekleştirilir. Boş kuyucuklar, erimiş istifleme jeli ile doldurulur ve elektroforez, gece boyunca 1.0 mA/Cm’lik daha düşük bir hızda gerçekleştirilir.

Elektroforez tamamlandığında jeller izopropanol solüsyonunda sabitlenir, preslenerek kurutulur ve %10 tavşan serum solüsyonunda yıkanır. Otoradyografi, jellerin 125I etiketli anti-insan VWF antikoru (DAKO Ltd) içinde gece boyunca inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir.

Reaksiyona girmemiş antikoru ayrıştırmak için kapsamlı bir yıkamadan sonra, jeller kurutulur ve X-ışını filmleri kullanılarak otoradyograf plakaları üretilir ve geliştirmeden önce 2-5 gün boyunca 70°C’de tutulur.

Sonuçların Yorumlanması

Otoradyografi son derece hassas bir yöntemdir ve maruz kalma miktarı değiştirilerek aynı jelden farklı yoğunluklarda farklı otoradyografiler elde edilebilir. Plazmadaki normal VWF:Ag modeli, von Willebrand Faktörünün multimer bantlarının tüm aralığını gösterir. Bunlar yüksek, orta ve düşük moleküler ağırlıklı multimerlerden oluşur.

Her multimer bandı, ana merkezi ve iki soluk fakat eşit derecede boyanmış uydu bantları (a ve b) olmak üzere bir üçlü banttan oluşur. VWF:Ag multimerlerinin en iyi yayılımı orta çözünürlüklü (%1.3-1.5) agaroz jelde görülür, yüksek moleküler ağırlıklı multimerlerin kaybı en iyi düşük çözünürlüklü (%1.0-1.3), agaroz jellerde ve üçlüde araştırılır. yüksek çözünürlüklü (%1.8-2.2) agaroz jellerde bant anormallikleri de vardır.

Bu nedenle, tam bir multimerik analiz için iki veya üç farklı jel konsantrasyonu kullanılmalıdır. Bu kolay bir teknik değildir ve her çalışma diğerinden farklılık gösterebilir ve elektroforetik koşulların bireysel optimizasyonunu gerektirebilir. Her multimer modelinin dansitometrik analizi, bazı tip 2A VWD hastalarında multimer kazancı veya kaybı miktarının ölçülmesine de yardımcı olabilir.

Normal trombosit VWF:Ag multimer bantları plazmadan görülenlerden farklıdır. Trombositlerde plazmadan çok daha büyük multimerler bulunur ve multimerik organizasyon da farklıdır.

Daha küçük multimer bantları bir ikiliden oluşuyor gibi görünmektedir ve merkezi bantlar plazmadaki karşılık gelen multimerlerden daha az göç eder. Trombosit multimer analizinden elde edilen bilgiler, bazı tip 2A VWD hastalarının tedavi tipine karar vermede yardımcı olabilir ve bu hastalarda mevcut mutasyon tipine de karşılık gelir.

Ristosetin Kaynaklı Trombosit Agregasyon Testi (RIPA)

VWF glikoproteininin ana işlevlerinden biri, trombosit membranı GPIb-IX reseptör kompleksindeki GPIb ile etkileşim yoluyla vasküler yaralanma bölgesinde subendotelyuma trombosit yapışmasını teşvik etmektir. VWF’nin A1 alanına eşlenen bu fonksiyonel alan, birincil hemostazda önemli bir rol oynar.

Bu alandaki kusurlar, VWF’nin trombosit GPIb’ye ​​afinitesinde artışa neden olur. Ancak bu tromboza neden olmaz, paradoksal olarak kanamaya neden olur. Tip 2 VWD’nin bu nadir fenotipi, tip 2B olarak adlandırılır ve karakteristik fonksiyonel anormalliği, ristosetin ile indüklenen trombosit agregasyon testi (RIPA) ile de tespit edilir.

Antibiyotik ristosetin, VWF’nin trombositten zengin plazmada (PRP) trombosit GPIb’ye ​​bağlanmasını indükler ve farklı ristosetin konsantrasyonları ile trombosit aglütinasyon derecesi bu tahlilin temelini de oluşturur.

Bu anormalliğin yanı sıra, 2B VWD, VWF:Ag’nin multimerik analizi ile tanımlanan plazmada yüksek moleküler ağırlıklı multimerlerin (HMWM’ler) seçici olarak yokluğu ile de karakterize edilir. Aslında, tip 2B VWD’li hastalar, trombositler ve endotelyal hücrelerdeki normal multimerik VWF:AG multimer paternleri ile gösterildiği gibi, VWF multimerlerinin tamamını sentezleyebilir, ancak anormalin artan afinitesi nedeniyle HMWM’ler dolaşımdan temizlenir. Trombosit GPIb reseptörü için VWF de kullanılır.

Burada açıklanan RIPA metodolojisi, 1977’de açıklanan orijinal çalışmanın bir modifikasyonudur. Ristocetin (Paesel-Lore), Trisbuffered salin, pH 7.4 ve beş farklı solüsyonda sulandırılarak 0.50, 0.1, 0.125 ve 0.15 mg/ml nihai konsantrasyonlar elde edilir, tahlilde kullanılmak üzere de hazırlanmıştır.

The post Multimerik Analizi – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

En sonunda, yukarıda belirtilen tüm çabalar, bir CZE yönteminin, ” somatropin ”, ” ” somatropin yığın çözeltisi ” ve ” somatropin monograflarına dahil edilmesine yol açmıştır. Avrupa Farmakopesinde ” enjeksiyon için ”. 71 CZE, 13,2 g / l amonyum fosfat tamponu pH 6,0 ve 195 nm’de UV saptama kullanan deamide gibi yüklü varyantlar için tanımlama prosedürünün bir parçası olarak ve testte kullanılır. formlar.

İnsülin, iyi bilinen biyosentetik olarak üretilen bir protein hormonudur. İnsülinin seyreltik asit muamelesiyle bozunma sorumluluğu, CZE, doğal PAGE ve LC ile belirlendi.

Ana bozunma ürünleri olarak iki tip deamide insülin tanımlanmıştır. Farklı teknikler arasında mükemmel bir korelasyon gözlemlendi. İnsülin ve deamidasyon ürünleri arasında başarılı bir ayırma elde etmek için çalışan tampona zwitteryonların ve ACN’nin ilave edilmesinin gerekli olduğu bulundu.

İnsülini ölçmek için hem bozunma ürünleri hem de yaygın olarak kullanılan koruyucu m-kresol ana bileşikten ayrılmalıdır. Bozunma ürünleri ve m-kresol varlığında insülin deneyi için doğrulanmış bir CZE yöntemi, iki LC yöntemiyle karşılaştırıldı.

850 mM 2- (N-sikloheksilamino) etansülfonik asit ve% 10 (h / h) ACN içeren 50 mM’lik bir sodyum asetat tamponu, daha yüksek ayırma verimliliği ve LC tahlillerinden dört kata kadar daha kısa bir analiz süresi gösterdi. Dahası, ACN buharlaşmasından kaçınıldıysa, tekrarlanabilirlik LC yöntemlerinden daha iyi oldu.

Tagliaro ve arkadaşları tarafından yürütülen bir çalışma. farklı kalsitoninlerin ve kalsitonin triptik sindirimlerinin ayrılması için bir CZE yöntemi geliştirmek, pH’ın kılcal duvara protein adsorpsiyonu üzerindeki etkisini güzel bir şekilde örneklemektedir. Düşük pH, kılcal duvarın yükünü azaltır, böylece elektrostatik etkileşimleri zayıflatır. Alternatif olarak, proteinin pl değerinin üzerinde çalışmak elektrostatik itilmelere neden olabilir.

İki tampon sisteminde, yani 50 mM sitrat tamponu pH 2.5 ve 50 mM borat tamponu pH 9.5’te insan kalsitoninlerinin ve somon kalsitoninin tam bir çözünürlüğü elde edildi. Ayrıca, sitrat tamponunda somon kalsitonininin son dört tripsin parçalama fragmanının ve en azından geçici olarak dokuz ara bölünme ürününün ayrılması sağlandı.

RDNA’dan türetilen proteinlerin çoğu glikosile edilmiştir, yani karbonhidrat grupları polipeptidik zincirde N- veya O-bağlantısı yoluyla kovalent olarak bağlanmıştır. Rekombinant glikoproteinlerin oligosakkarit yapısı, büyük ölçüde gen ekspresyonu için kullanılan sisteme ve kültür koşullarına bağlıdır.

Glikoproteinler genellikle, içinde farklı oligosakaritlerin düzeneklerinin her bir glikosilasyon bölgesine translasyondan sonra eklendiği heterojen glikosile varyant popülasyonları (glikoformlar) olarak bulunur. Karbonhidrat kısımları yapılarında ve işlevlerinde önemli bir rol oynar. Oligosakarit yapısındaki varyasyonlar, çözünürlük, spesifik aktivite, antijenite ve termal denatürasyon gibi birçok protein özelliğini önemli ölçüde etkileyebilir.

Proteinler Nedir
Proteinler nelerdir
Proteinler Biyoloji
proteinlerin birincil ikincil, üçüncül ve dördüncül yapısı
Yapısal proteinler
Globüler proteinler
En çok protein içeren besinler
protein nedir, ne işe yarar

Aynı fermantasyon ortamında aynı proteinin birkaç glikosile edilmiş formu bulunduğunda, bu formların detaylı bir analizi zorunludur. CZE, bu amaç için çok uygundur, çünkü varyantlar, çeşitli sialilasyon, sülfatasyon veya fosforilasyon derecelerinin yanı sıra kütle farklılıkları ile ilgili yük farklılıklarına göre ayrılabilir.

Rekombinant glikoproteinlerin CE’deki ilerlemeleri başka bir yerde tartışılmıştır. Rekombinant insan eritropoietini (rhEPO), biyoteknolojik olarak üretilen bir glikoproteinin önemli bir örneğidir. RhEPO’nun farmasötik müstahzarları artık dünya çapında birçok üreticiden temin edilebilir.

PH, tampon tipi ve organik modifiye edicinin rhEPO.80 glikoformlarının CZE ayrılması üzerindeki etkisini incelemek için sistematik bir yaklaşım kullanıldı. Karma bir tampon, 100 mM asetat-fosfat pH 4.0 ile optimum çözünürlük elde edildi. 1,3-, 1,4- veya 1,5- diaminoalkanların ayırma tamponuna eklenmesi, bu katkı maddelerinin kılcal duvara bağlanması nedeniyle (gliko) proteinlerin çözünürlüğünü iyileştirebilir, böylece EOF ve proteinler ve kaynaşmış silika duvar arasındaki etkileşim.

Bu faydalı etki, tüm ana rhEPO glikoformlarını ayırmak için kullanılmıştır. 1,4-diaminobutanın işletim tamponuna dahil edilmesiyle mükemmel çözünürlük elde edildi. BGE’de üre varlığı, protein agregasyonunu baskılayarak ayrılmaya daha da yardımcı oldu. Sonuçlar, ayrılmanın, glikoformlarda bulunan sialik asitlerin sayısının artması sırasına göre gerçekleştiğini gösterdi.

Yukarıda bahsedilen yöntem daha sonra çalışan tamponu biraz değiştirerek geliştirildi ve makul analiz süresi içinde sekiz bant rhEPO glikoform ayrıldı (bkz.Şekil 2) .82 Yöntemi lazerle indüklenen floresans (LIF) saptama ile uyumlu hale getirmek için, ek uyarlamalar 1,4-diaminobutanın morfolin ile değiştirilmesi dahil gerçekleştirildi.

Son olarak, bir CZE / ESI / MS yöntemi geliştirildi. Hiçbir tampon katkı maddesi kullanılmadı ve çıplak erimiş silika kapiler dinamik olarak poli (etilen imin) kaplı bir kapiler ile değiştirilerek protein adsorpsiyonu önlendi. Ancak bu koşullarda taban çizgisi ayrımı elde edilemedi.

Rekombinant proteinlerin analizi zor olabilir çünkü terapötik doz için gerekli aktif protein miktarları, eklenen büyük miktarlarda eksipiyanlara kıyasla genellikle küçüktür. Eksipiyanlar aynı zamanda, genellikle büyük plazma havuzlarından elde edilen ve kimyasal olarak homojen olarak kabul edilemeyen insan serum albümini (HSA) gibi proteinler olduğunda da özellikle zorluklarla karşılaşılır.

200 mM sodyum fosfat tamponu pH 4.0 ve 1 mM nikel klorürden oluşan bir elektroforetik tampon, rhEPO ve HSA’nın tamamen ayrılmasına ve ayrıca rhEPO’nun birkaç glikoform popülasyonuna ayrılmasına izin verdi.

Nikelin HSA ile seçici olarak etkileşime girdiği gösterildi. İki üreticinin ürünleri analiz edildi ve biyolojik aktivite birimleri açısından çok az kalitatif ancak önemli miktarlarda partiden partiye farklılıklar gösterdi. Peptid haritalama, glikoproteinlerdeki karbonhidrat eklerinin konumlarındaki ve dağılımlarındaki değişiklikleri izlemek için de yararlıdır.

CZE, Çin hamsteri yumurtalık hücrelerinden ifade edilen rhEPO’nun peptit haritasını karakterize etmek için uygulanmıştır. Metodoloji, peptit çözünürlüğünü artırmak, analit-duvar etkileşimlerini azaltmak ve glikopeptit mikroheterojenliğini değerlendirmek için 40 mM sodyum fosfat tamponu pH 2.5 içinde bir iyon eşleştirme maddesi olan 100 mM heptanesülfonik asit kullandı.

Toplam triptik harita, glikosile edilmemiş ve glikosile edilmiş peptitler olmak üzere iki bölgeye ayrıldı ve 16 triptik peptidin ve iki peptitten oluşan bir çift tepe noktasının taban çizgisi ayrılmasıyla sonuçlandı. Endoproteinaz V8 sindirilmiş rhEPO’nun karakterizasyonu için analitik bir yöntem olarak CZE / MS’nin bir değerlendirmesi yapılmıştır.

Kapiler, polietilen glikol (PEG) mevcudiyetinde polibren ile dinamik olarak kaplandı ve ayırmalar, 0.67M formik asit içinde gerçekleştirildi. Glikosilasyon siteleri ve karbonhidrat dal desenleri kolaylıkla değerlendirildi. RhEPO’nun yapısını çözmek için CZE / ESI / MS, matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon MS uçuş süresi (MALDI / TOF / MS) ve çevrimiçi LC / ESI / MS aynı anda kullanılmıştır.

Glikoproteinler için, doğal proteinin analizi ve peptit haritalamasının yanı sıra üçüncü bir analitik yaklaşım, oligosakaritlerin enzimatik veya kimyasal bölünme ile salınması ve ardından karbonhidrat haritalama olarak da adlandırılan ayrılmalarıdır.

80 mM amonyum sülfat, 20 mM sodyum fosfat ve 2.0 mM 1,5-diaminopentan içeren optimize edilmiş bir tampon sistemi kullanılarak, sialile kompleks tipte N-bağlantılı glikanlar için bir veri tabanı oluşturulmuştur. Veritabanı rhEPO’dan salınan oligosakaritlerin yapısını doğrulamak için kullanıldı.

The post Proteinler – Farmasötik Analiz İçin Kapiller Elektroforez Yöntemleri – Ayırma Teknolojisi –FARMASÖTİK ANALİZ – Kimya Mühendisliği – Ayırma Teknolojisi Ödevleri – Kimya Mühendisliği Ödev Yaptırma – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

Kabul edilebilir hassasiyet, doğrusallık, LOD ve LOQ seviyeleri elde edildi. CZE ve MEKC kullanan analitik teknikler, beş florokinolon antibakteriyelinin ve bunların başlıca bozunma ürünlerinin analizi için geliştirilmiştir.

İncelenen bileşiklerin yük yoğunluklarının teorik olarak belirlenmesi, optimum ayırma tamponu koşullarının hızlı gelişmesine izin verdi. Enrofloksasinin hümik maddelerle ve hümik maddeler olmadan fotostabilitesinin doğal güneş ışığı koşullarında kantitatif olarak takip edilmesi için CZE yöntemi uygulanmıştır. CZE, antrakinon-1-sülfonat ve bununla ilgili safsızlıkların analitik olarak ayrılması için kullanılmıştır.

Optimal koşullar, pH 10.0’da bir borat çözeltisinin kullanılması anlamına geliyordu. Ticari bir poliamin kaplı kapiler olan eCAPt’nin uzun vadeli stabilitesi, trimetoprim ve bununla ilgili dört safsızlığın aynı anda belirlenmesi için geliştirilmiş onaylanmış bir yöntem kullanılarak test edildi.

Kılcal damarın minimum uzunluğa indirgenmesiyle, trimetoprim karışımının deneyi, 50 mM sodyum asetat pH 4.2 içeren bir BGE’de 3 dakikadan daha kısa bir sürede gerçekleştirildi. Kaplanmamış bir kapilerle karşılaştırıldığında, tüm bileşenler daha kısa bir toplam göç süresinde ve baştan sona daha yüksek tepe verimlilikleriyle açıkça çözüldü. Kloramfenikol (CAP), bir amid grubuna sahip bir antibiyotiktir.

Sulu çözeltilerde, 2-amino-1- (4-nitrofenil) -propan-1,3-diol (ANP) verecek şekilde hidrolize olacaktır. Bir karbon disk elektrotunda ECD bulunan CZE, CAP ve hidrolitik safsızlığının belirlenmesi için analitik yöntem olarak araştırılmıştır.

Yöntem onaylandı ve ticari olarak temin edilebilen göz damlalarında CAP ve ANP’yi izlemek için başarıyla uygulandı. ECD ayrıca hidrazin, metilhidrazin ve izoniazidin CZE analizi için tercih edilen tespit moduydu. 4-piridil hidrokinon kendi kendine monte edilmiş bir mikrodisk platin elektrot, analitler için çok yüksek bir katalitik yetenek gösterdi.

Globüler proteinler
Yapısal proteinler
Biyokimya proteinler pdf
Konjuge proteinler
Polipeptit nedir
Peptit
Katalitik proteinler
Polipeptit hidrolizi

Peptitler ve Proteinler

Son yıllarda rekombinant DNA (rDNA) teknolojisi, ilaç sektöründe önemli bir ilgi görmüştür ve artan miktarda biyoteknoloji türevi eczacılık ürünleri geliştirilmekte ve pazarlanmaktadır. Biyoteknolojik üretim prosesleri, bakteriler, mayalar ve memeli hücreleri dahil olmak üzere çeşitli konakçı hücreleri içerir. Doğal olarak, fermentasyon ortamından ekstraksiyon ve bir dizi saflaştırma aşamasının gerçekleştirilmesi gerekir.

Glikosilasyon, değişen N-terminal dizisi, amino asit modifikasyonları ve proteolitik kırpma gibi heterojenlik için birçok fırsat mevcuttur. Düzenleyici kurumlar, saflaştırılmış ürünün kapsamlı bir şekilde karakterize edilmesini gerektirir ve ürün ve süreçten türetilen safsızlıkları ve kirleticileri kontrol etmek ve izlemek için yönergeler sağlamıştır.

Bu safsızlıklar sadece ürün kalitesi ve etkinliği üzerinde derin bir etkiye sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda eser miktarlarda bile istenmeyen ve bilinmeyen yan etkilere neden olabilir. Bu karmaşıklığa sahip örneklerle, hiçbir teknik makromolekülü analiz etmek için gereken yapısal bilgi derinliğini vermez.

UV ve floresans spektroskopisi, nükleer manyetik rezonans (NMR), X-ışını kristal-lografisi, N ve C-terminal amino asit analizi, biyolojik aktivite testleri, MS, LC, sodyum dodesil dahil olmak üzere ortogonal seçiciliğe sahip çok çeşitli analitik teknikler sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), izoelektrik odaklama ve CE, protein bütünlüğünü, yan ürünleri ve üretim tutarlılığını belirlemek için aynı anda kullanılabilir. CE’nin rekombinant protein analizi için bir araç olarak faydası geçmişte kapsamlı bir şekilde tartışılmıştır.

Rekombinant proteinlerin safsızlık profillemesinde bir dizi CZE uygulaması aşağıda sunulmuştur. Tedavi amaçlı kullanılanlara daha çok dikkat edilir.

İnsan büyüme hormonu (hGH), rDNA teknolojisi ile üretilen birinci nesil farmasötik ürünlerden biridir. Rekombinant hGH (rhGH) veya somatropinin CZE analizi üzerine çok sayıda çalışma rapor edilmiş ve protein karakterizasyonu ve saflık testinde kullanılan farklı yaklaşımları göstermektedir.

Somatropin, Escherichia coli hücrelerinde, N-terminal olarak genişletilmiş negatif yüklü bir öncü olarak rekombinant olarak üretilir. Saflaştırma işlemi sırasında, N-terminal uzantısı spesifik olarak klivaj edilir. Fermantasyon ortamında çeşitli ilgili maddelerin, örneğin deamide rhGH, bölünmüş rhGH, oksitlenmiş rhGH ve oligomerik agregaların oluştuğu bilinmektedir.

Proteinlerin CZE ayrılmasında karşılaşılan istenmeyen sorunlardan biri, pozitif yüklü analitin kılcal duvar üzerine adsorpsiyonudur, bu da pik tortulaşmaya ve zayıf çözünürlüğe neden olabilir. Silanol gruplarının kimyasal modifikasyonla korunması, protein2 kapiller duvar etkileşimini en aza indirmenin bir yoludur.

Bu nedenle, E. coli sitozolündeki rhGH öncüsünün içeriğini ölçmek için geliştirilen bir CZE yöntemi, hidrofobik C18 kaplı kapilerler ve% 7.5 (v / v) metanol içeren 150 mM trişin tamponu pH 7.55 kullanmıştır.

Sitozol numunelerinde deamide formların varlığının değerlendirilmesinin yanı sıra kesin tespitler de mümkündü. Oldukça konsantre bir ayırma tamponu kullanmak, protein adsorpsiyonunu baskılamak için başka bir stratejidir.

CZE, fosfatla etkisiz hale getirilmiş erimiş silika kılcal damarlar ve% 1 (v / v) propilen glikol içeren 250 mM fosfat pH 6.8 içeren bir BGE, çözülmüş rhGH ve ham E. coli hücre macunu özü karışımlarından varyantları içerir.

RhGH saflığının değerlendirilmesi için bir CZE yönteminin doğrulanması da açıklanmıştır.68 100 mM amonyum fosfat tamponu pH 6.0, hGH’yi ilgili safsızlıklarından ayırmıştır, yani bölünmüş form, monodamide edilmiş form ve ortaya çıkan iki yeni bileşik E. coli’deki çeviri sonrası modifikasyonlardan.

Tüm bileşikler, farmasötik preparatlarda eşzamanlı olarak ölçülebilir. Şimdiye kadar bahsedilen örnekler, bozulmamış proteini analiz etti. Bununla birlikte en kapsamlı bilgi, rekombinant proteinin peptit haritalarının analizinden gelir. Peptit haritalama, ilaç düzenleyici bakış açısından, doğal muadillerle yapısal eşdeğerliği göstermek için önemli bir gerekliliktir ve amino asit dizisini izlemek için anahtar bir yöntemdir.

Bu teknik, hGH gibi orta büyüklükteki proteinlerdeki küçük değişikliklerin tespitini sağlar ve ticari olarak temin edilebilen kütle spektrometrelerinin ortaya çıkması sırasında gücü önemli ölçüde artmıştır. Peptit haritalamasında, bozulmamış protein, bölünmenin seçiciliğine bağlı olarak bir peptit karışımı ile sonuçlanan bir proteolitik enzim tarafından sindirilir.

Bu parçaları ayırarak, proteinin bir parmak izi oluşturulabilir. İndirgeyici olmayan koşullar altında rhGH’nin tripsin sindirimi ile üretilen 19 peptid parçasının ayrılmasına CZE uygulanmıştır. Parçaların neredeyse tamamı 15 dakikadan daha kısa bir sürede çözüldü. Aynı grup tarafından yapılan sonraki bir çalışmada, elektrolit bileşimi, triptik parçaların ayrılması için optimize edildi.

The post Peptitler ve Proteinler – Farmasötik Analiz İçin Kapiller Elektroforez Yöntemleri – Ayırma Teknolojisi –FARMASÖTİK ANALİZ – Kimya Mühendisliği – Ayırma Teknolojisi Ödevleri – Kimya Mühendisliği Ödev Yaptırma – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).