PCR temel olarak nokta mutasyonlarının, delesyonlarının ve DNA polimorfizmlerinin saptanması için uygulanır. Bu teknik, ilgili DNA’nın bir bölgesini basit ve hızlı bir şekilde amplifiye eder ve yaklaşık 12. gebelik haftasında CVS ile elde edilebilen çok küçük bir numune gerektirdiğinden doğum öncesi tanı için özellikle uygundur.

PCR ilkesi, ilgilenilen DNA bölgesini çevreleyen sentetik primerler (kısa tek sarmallı DNA dizileri) ve bir termostabil DNA polimeraz (Taq polimeraz) kullanılarak DNA sentezini içerir.

Büyük miktarlarda DNA’nın enzimatik amplifikasyonu, bir agaroz jelde lekeli DNA fragmanlarının doğrudan görselleştirilmesine izin verir. Tek bir baz ikamesi, PCR ürününün spesifik DNA dizilerini tanıyan kısıtlama enzimleri ile sindirilmesini takiben DNA fragman boyutlarındaki değişiklik ve ardından “Southern blot” ile tanımlanabilir. Ancak, bu zaman alıcıdır ve radyoizotopları içerir.

Aranan kesin moleküler kusur önceden biliniyorsa, kısıtlama enzimleri veya radyoizotoplar kullanılmadan spesifik mutasyonların test edilmesine izin veren ve böylece sonuçların 24 saat içinde elde edilmesini sağlayan PCR’ye dayalı yeni teknikler geliştirilmiştir.

Böyle bir teknik, alel spesifik primerleri kullanan ‘amplifikasyon refrakter mutasyon sistemi’dir (ARMS). Bu teknikte, biri normal alleli ve diğeri mutant alleli tamamlayıcı olmak üzere iki farklı primer kullanılır, yani bunlar sadece mutasyon bölgesinde farklılık gösterir.

Primer ve DNA dizileri tamamlayıcı ise, primerler bir PCR ürünü verir. Böylece normal ve mutant primerler, sırasıyla normal ve mutant alelleri çoğaltacaktır. Bu teknik kullanılarak hastanın DNA’sı belirli bir gen mutasyonu için test edilebilir, örn. HbS.

Von Willebrand faktör ristosetin kofaktör
Von Willebrand hastalığında beslenme
Von Willebrand faktör antijeni referans aralığı
Von Willebrand faktör kaç
Von Willebrand HASTALIĞI ppt
Von Willebrand faktör ne ise yarar
Von Willebrand faktör görevi
Von willebrand ekşi

A, S, C, E ve yaygın talasemi genotiplerinin çoğu için primerler sentezlenmiştir. -Talasemide, her etnik grupta sınırlı sayıda kusurun yaygın olduğu bulunmuştur. Bu nedenle, hastanın etnik kökeni, ilk ekranda yüksek bir pozitif tanımlama olasılığı ile, analizde ilk olarak kullanılacak belirli bir primer setini belirleyecektir.

GAP-PCR, DNA’daki büyük “boşlukların” (delesyonların) tespit edildiği bir tekniktir ve çoğunlukla delesyon kaynaklı olan yaygın þ ve 0 talasemi formlarının tanısında faydalıdır. Ayrıca Hb Lepore, -talasemi ve HPFH’nin delesyonel formlarının moleküler tanısında da kullanılmaktadır.

Multiplex PCR, tek bir testte bir dizi farklı mutasyonun (örn. bilinen tüm þ ve 0 talasemiler) eşzamanlı olarak gösterilmesi/dışlanması için kullanışlı bir tekniktir.

Spesifik mutasyonlar veya delesyonlar için tarama yapılırken yukarıda bahsedilen PCR tabanlı teknikler kullanılır. Bununla birlikte, moleküler kusur belirlenmemişse, varsayılan mutasyon, genin doğrudan dizilenmesiyle belirlenebilir.

Özel von Willebrand Faktör Araştırmaları

von Willebrand hastalığı (VWD) ilk olarak 1926’da Erik von Willebrand tarafından Finlandiya’daki A ̊ kara takımadalarından büyük bir ailenin birkaç üyesinde tanımlandı.

1953’te, azalmış faktör VIII (EVIII) prokoagülan aktivitesi ile VWD arasında bir ilişki tespit edildi, bu da hemofili A ve VWD’den sorumlu proteinin doğasına ilişkin bazı kafa karışıklığına yol açtı.

Ancak FVIII ve VWF’nin immünolojik ve moleküler yapılarının daha iyi anlaşılması, 1986’da FVIII’in ve 1989’da VWF’nin gen haritalaması ve cDNA klonlamasına yol açan 1970’lerin sonlarına kadar değildi.

VWD, heterojen bir fenotip ile konjenital kanama bozukluklarının en yaygın olanıdır. VWF’nin plazma ve/veya trombositlerdeki kantitatif (tip 1 ve 3) veya kalitatif (tip 2 varyantları) kusurlarından kaynaklanır.

Bu büyük multimerik glikoproteinin (10–20 106 kDa) hemostazda iki ana rolü vardır; FVIII’nin taşıyıcısı ve proteolitik koruyucusu olarak hareket eder ve damar yaralanmasından sonra subendotelyuma trombosit yapışmasının aracısı olarak hareket eder.

VWF, endotel hücrelerinde ve megakaryositlerde, 12p13.2 pter’de kromozom 12’nin telomerik ucundaki 180 kb VWF geninden kaynaklanan 9 kb $’lık bir mRNA transkripsiyonu ile sentezlenir.

VWF’nin orta kısmından alınan bir cDNA probu kullanılarak yapılan lokalizasyon çalışmaları, sadece bu kromozom üzerindeki otantik geni değil, aynı zamanda 22q11-23’te kromozom 22 üzerinde bir psödojen dizisini de tanımlamıştır.

Bu psödojen 21-29 kb uzunluğundadır, DNA VWF geninin 23-34 eksonlarını kodlayan bölgenin hem ekzonlarına hem de intronlarına karşılık gelir ve dizilimde sadece %3.1 sapma vardır.

VWF geninin, homolog alanların büyük dahili tekrarına sahip 2813 amino asit (aa) öncüsünün (Prepro-VWF) bir translasyon ürününü kodlayan, yaklaşık 178 kb’lik bir alanı kapsayan 52 ekzonu vardır. VWF’nin propeptidi (763 aa) ve olgun alt birimi (2050aa), aşağıdaki sırayla tekrarlanan alanlardan oluşur: D1–D2–D0 –D3–A1–A2–A3–D4–B1–B2–B3–C1 –C2–CK.

Salgılanmadan önce VWF, D1-D2 propeptid bölünmesini, ardından 12 N-bağlı ve 10 O-bağlı oligosakaritlerle glikosilasyon ve multimerizasyon dahil olmak üzere kapsamlı bir translasyon sonrası işleme tabi tutulur. VWF’nin N-bağlı oligosaceharidlerinden bazıları, ABO kan grubu belirleyicilerini taşıma gibi olağandışı bir özelliğe sahiptir.

VWF molekülünde birkaç fonksiyonel alan tanımlanmıştır ve çeşitli VWD tiplerinden sorumlu mutasyonların çoğu bu bölgelere haritalanmıştır.

Fenotipik ve genotipik testlerden elde edilen sonuçlar, farklı VWD tiplerinin teşhisi ve sınıflandırılmasının temelini oluşturur. Bununla birlikte, bu tür testlerden daha fazla ayrıntı ortaya çıktıkça, daha kesin teşhis ve karmaşık sınıflandırma düzenli olarak ortaya konmuştur.

VWD’nin revize edilmiş bir sınıflandırması 1994’te yayınlandı, ancak halihazırda değiştirilmiş ve her VWD tipinden sorumlu daha fazla mutasyon tanımlandığından, fonksiyonel kusurlara ve mutasyonlara dayalı daha yeni bir sınıflandırma önerilmiştir.

İngiltere, Birmingham’daki Uluslararası Tromboz ve Hemostaz Derneği’nin 2003 XIX Kongresinde, çeşitli sunumlar VWF’nin moleküler tanı ve geliştirilmiş multimerik analizine dayalı yeni bir VWD sınıflandırmasına duyulan ihtiyacı vurguladı.

Tip 1 VWD grubuna sahip pek çok sınıflandırılamayan hasta ile, böyle gelişmiş bir multimerik yöntemin bu hastaların gelecekte sınıflandırılmasına yardımcı olacağı öne sürülmüştür.

Bu bölümde, VWD’nin teşhisi ve sınıflandırılması için şu anda kullanılan üç özel fenotipik test anlatılmaktadır. Bunlar VWF:Ag’nin multimetik analizidir ve her tip VWD’nin ayırıcı tanısı için kullanılır; tip 2B VWD tanısı için gerekli olan ristosetin kaynaklı trombosit agregasyonu; ve son olarak tip N ‘Normandy’ VWD teşhisi için VWF/ FVIII bağlama testidir.

VWF geninin tanımlanmasının üzerinden çok zaman geçmemiş olsa da, moleküler testler şimdi kapsamlı bir şekilde tanıtılmış ve kısa bir metodoloji ve mutasyon tespiti için bazı yaklaşımlar da açıklanmıştır.

The post von Willebrand Faktör Araştırmaları – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).