Yukarıda açıklanan nicel yöntemler, destekleyici jel ortamında gözle görülebilen çözünmeyen protein-antikor komplekslerinin oluşumuna dayanır. Çökelti sıvı bir ortamda düşük konsantrasyonlarda bir protein ve antikor tarafından oluşturulursa, süspansiyonda daha ince bir çökelti oluşur. Bu özellik, protein konsantrasyonunu ölçmek için kullanılabilir.

Bir çökeltinin mevcudiyeti, süspansiyondan geçen bir ışık huzmesinin geçişini engelleyecektir (bulanıklık). Alternatif olarak, süspansiyon tarafından saçılan ışık, gelen ışığa açılı olarak algılanabilir. Bu yönteme nefelometri denir.

Sabit bir antikor konsantrasyonunda immünopresipitat miktarı, antikorun tamamı antijene bağlanana kadar protein konsantrasyonuyla orantılı olarak artacaktır. Işık saçılımının ölçümü bu nedenle antikor fazlalığı koşullarında yapılmalıdır.

Bu, ya bir “son nokta” olarak ya da çökelti oluştukça saçılmadaki artışı ölçen bir hız analizcisi tarafından yapılır. Açıkça bu yaklaşım, radyal immünodifüzyon gibi daha da “düşük teknolojili” yöntemlerin aksine, özel aparatlar gerektirir, ancak bir dereceye kadar otomasyon ve büyük miktarda numune sunar.

Bazı laboratuvarlar, santrifüjleme sırasında reaktiflerin karıştırıldığı santrifüj analizörleri kullanır ve bu, test süresini azaltır. Sistemde olduğu gibi bu metodolojinin hassasiyet sınırı ve özellikle poliklonal olması gereken antiserum kalitesidir.

İyi bir sistemde, sınır yaklaşık 10 mg/l’dir, ancak bu, antikorlar küçük polistiren boncuklara bağlandığında “parçacıkla güçlendirilmiş” nefelometri kullanılarak yaklaşık iki büyüklük sırası ile iyileştirilebilir. İmmünoglobulin izotipleri ve alt sınıfları gibi klinik olarak önemli proteinlerin türbidimetri ve nefelometrisi için reaktifler ticari olarak mevcuttur.

Türbidimetri
Nefelometri nedir
Türbidimetrik yöntem Nedir
Türbidimetri çalışma prensibi
Türbidimetri Nedir
TÜRBİDİMETRİ ve Nefelometri tekniği
Türbidimetri cihazı
Türbidimetre

Enzim bağlantılı immünosorbent deneyleri

Enzim-bağlı bağışıklık tahlilleri (ELISA), aynı zamanda enzim-bağışıklık tahlilleri (EIA) olarak da adlandırılır, protein ölçümü için radyo-bağışıklık tahlillerinin yerini büyük ölçüde almış çok yönlü ve hassas bir prensibi temsil eder.

Proteinleri yaklaşık 1 mg/l konsantrasyona kadar ölçebilirler. İlgilenilen protein düşük konsantrasyonda mevcutsa kullanmak için uygun deneylerdir. Bu tahliller 96 oyuklu plastik plakalarda gerçekleştirilir ve reaktif kullanımı genellikle çok kanallı pipetler veya hatta otomatik pipetleme istasyonları aracılığıyla yapılır.

ELISA, otomasyona veya yarı otomasyona son derece uygundur ve bu nedenle, ölçülen protein yüksek konsantrasyonda olsa bile, numune seyreltmesini gerektirse bile, çok sayıda numune işleniyorsa bu teknik diğer basit yöntemlerden daha uygun olabilir, Radyal immünodifüzyon gibi.

Birçok laboratuvar kendi kurum içi ELISA sistemlerini oluşturur, ancak klinik olarak önemli serum proteinlerini, sitokinleri, mikrobiyal antijenleri (örn. Chlamydia trachomatis; Hepatit B virüs anti-virüslerini) ölçmek için testler de dahil olmak üzere çok çeşitli uygulamalar için ticari olarak mevcut kitler mevcuttur. gens), alerjenlere karşı IgE antikorları ve patojenlere karşı antikorlar.

NOT: (a) Dolaylı ELISA. Şekil, spesifik antikorların tespiti için bu tekniğin prensibini göstermektedir. (b) Bir numunedeki spesifik bir antijeni saptamak için doğrudan sandviç ELISA. (c) Bilinen bir antijene yönelik spesifik bir antikoru saptamak veya ölçmek için rekabetçi ELISA.

Yöntem, ölçülecek ‘hedef’ antikor olarak aynı antijeni tanıyan, tavşan veya koyun gibi bir hayvanda yetiştirilen (enzim-konjuge) bir antikora dayanır. Örnek, ELISA plakası üzerinde hareketsizleştirilmiş antijene bağlanmak için rekabet eden konjuge antikor ile karıştırılır.

(d) Bir proteini (antijeni) saptamak veya ölçmek için rekabetçi ELISA. Test edilen numune, ilgilenilen antijene (bu durumda bir tavşan antikoru) üretilen bir antikor ile inkübe edilir. Tavşan antikoru numunedeki hedef antijene bağlanır ve bu antikor moleküllerinin daha sonra antijen kaplı ELISA kuyusuna bağlanmasını önler.

Ön inkübasyonda antijene bağlanmamış herhangi bir tavşan antikoru, ELISA kuyusuna bağlanabilir ve tavşan IgG’sine (bu durumda koyun anti-tavşan IgG’si) enzim konjuge bir antikorun eklenmesiyle saptanır. Ölçülen enzim-substrat ürünü miktarı, orijinal numunedeki hedef protein miktarı ile ters orantılı olacaktır.

Farklı tahlil sistemleri ayrıntılı olarak farklılık gösterir, ancak temel ilkeler benzer kalır. En basit formlar, spesifik antikorları saptamak için “dolaylı ELISA” ve antijenleri saptamak için “doğrudan sandviç ELISA”dır.

Antikor tespiti için dolaylı ELISA (Şekil 45.8a), uygun bir hedef antijen (örn. bir patojenden protein) ile kaplanmış mikrotitre plaka kuyularına dayanır. Test edilen numuneler oyuklara uygulanır, ardından insan immünoglobulinine enzimle konjuge bir antikor uygulanır.

Enzim genellikle yaban turpu peroksidaz (HRP) veya alkalin fosfatazdır. Anti-insan immünoglobulinin seçimi, tüm izotiplerin (insan immünoglobulinleri IgG, IgA ve IgM’ye karşı oluşturulan antiserum kullanılarak) veya spesifik bir izotipin (örn., alerjenlere karşı IgE antikorları) saptanmasına olanak tanır.

Bağlanmamış konjuge antikoru uzaklaştırmak için daha fazla yıkamadan sonra, oyuklara uygun bir substrat eklenir. Uygun dalga boyunda (HRP için 450 nm; alkalin fosfataz için 492 nm) toplanan bir ELISA okuyucusu kullanılarak saptanan renkli bir ürün, orijinal numunede hedef antikoru gösterir. Bu testler nicel olabilir.

Antijenleri saptamak için doğrudan sandviç ELISA için, 96 oyuklu mikroplakaların (sekiz oyuklu şeritler olarak da elde edilebilir) oyukları, saptanan veya ölçülen proteine ​​karşı bir antikor ile kaplanır. Bunun bir çökeltici antikor olması gerekmez ve genellikle monoklonal antikorlar kullanılır.

Her kuyu, bir test numunesi veya bilinen konsantrasyonlarda bir dizi referans çözeltiden biri ile doldurulur. Kuyucuklar uygun bir süre (genellikle yaklaşık 1 saat) için inkübe edilir, ardından kuyu yüzeyinde antikor tarafından yakalanmayan materyali çıkarmak için kuyular yıkanır.

Kuyucuklar daha sonra ölçülmekte olan proteine ​​karşı başka bir antikorun bir solüsyonu ile doldurulur. Açıkça, birincil antikor bir monoklonal ise, aynı monoklonal antikor bu adımda etkili olmayabilir çünkü hedef protein, o antikor tarafından tanınan yalnızca bir antijenik belirleyiciye (epitop) sahip olabilir.

Bu, plaka kuyularında hareketsiz hale getirilmiş birincil antikor tarafından yakalandıktan sonra proteini tanıyacak ikinci bir antikoru tanımlamak için bazı deneylerin gerekli olduğu yerdir. Bu ikinci antikor enzime konjuge edilir.

The post Türbidimetri ve Nefelometri – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

Nefelometrik ve/veya türbidimetrik algılama sistemlerini içeren immünolojik testler, belirli bir kolorimetrik reaktifin bulunmadığı belirli analitleri ölçmek için kullanılır, örn. C-reaktif protein (CRP), tamamlayıcı bileşenler C3 ve C4 ve bireysel immünoglobulinler.

Protein çözeltisi ve uygun antikor birlikte karıştırılır ve tek başına antikor veya proteinden daha fazla ışık saçan büyük kompleksler oluşturmak üzere reaksiyona girmesine izin verilir. Duyarlılık tipik olarak düşük mg/l aralığındadır. Mukopolisakkarit içeren idrara setilpiridinyum klorür eklendiğinde oluşan büyük ışık saçılımı, türbidimetrinin immünolojik olmayan kullanımına bir örnektir.

Türbidimetreler

Teoride, türbidimetri herhangi bir standart fotometre veya spektrofotometre ile ölçülebilir. Büyük bir arka plan sinyalinin varlığında iletilen ışıktaki küçük bir değişiklik ölçüldüğünden, yüksek sinyal:gürültü oranına sahip cihazlar tercih edilir.

Basit bir özel türbidimetre, bir kuvars halojen ışık kaynağı, dar bantlı bir girişim filtresi, bir numune küveti tutucusu ve bir fotodiyot veya foto çoğaltıcıdan oluşacaktır.

Kısa dalga boylu ışığın kullanılması, artan saçılma ve dolayısıyla daha büyük bir sinyal avantajı sunar, ancak biyolojik çözümlerde ışığın absorpsiyonu da artacaktır. Sonuç olarak antijen-antikor kompleksi oluşumu genellikle 340-400 nm aralığında ölçülür.

İyi bir hassasiyet için zaman ayarlı reaktif ekleme, karıştırma ve okuma gereklidir. Parçacık boyutu zamanla yavaşça arttığında, iletilen ışıktaki azalma oranı en iyi şekilde çok noktalı ölçümlerden hesaplanır. Otomatik isteğe bağlı fotometrik analizörler, türbidimetrik immünolojik testler için yaygın olarak kullanılmaktadır.

Türbidimetri
Nefelometri nedir
Türbidimetre ne işe yarar
Türbidimetre Fiyat
Türbidimetri cihazı
Türbidimetri Nedir
Türbidimetre çalışma prensibi
Türbidimetre kullanımı

Nefelometreler

Nefelometreler genellikle bir ışık kaynağı, bir gelen ışık filtresi, bir numune tutucu ve doğrudan iletilen ışıktan kaçınmak için açılı olarak ayarlanmış bir dedektörden oluşur. Gelen ve yayılan ışık için filtrelerin (veya monokromatörlerin) aynı dalga boyuna ayarlanması şartıyla, saçılan ışığın 90 um’de ölçüldüğü florimetreler sınırlı hassasiyetle de kullanılabilir.

90’da ölçülen ışık dağılımı, ileri ışık saçılımından daha zayıftır. Teorik olarak en iyi hassasiyet, dedektör açısının mümkün olduğu kadar 180’e yakın yerleştirilmesiyle elde edilir. Bu, sıkıca odaklanmış bir ışık demeti ve mükemmel optikler gerektirir. Pratikte, klinik nefelometreler, gelen ışığın eksenine göre 90 ile 170 arasında dedektör açıları kullanır.

Gelen ışığa 90’dan farklı açılarda yapılan nefelometrik ölçümler en iyi şekilde kare yüzlü küvetlerden ziyade yuvarlak küvetlerden yapılır. Bu dedektör açılarında yuvarlak küvetler, ölçülen ışığın küvet duvarlarından yansımasını en aza indirir. Floresan ışığın dedektöre ulaşmasını önlemek için nefelometreler genellikle bir kesme filtresi ile donatılır.

Bir tungsten kuvars halojen ampul sıklıkla kullanılır. Alternatif kaynaklar arasında ksenon lambalar, cıva ark lambaları, ışık yayan diyotlar ve lazerler bulunur. Helyum neon lazer, odaklama veya kolimasyon optiği gerektirmeyen yüksek yoğunluklu, dar bir ışına sahip olduğu için özellikle nefelometri için kullanışlıdır.

Ne yazık ki, uzun dalga boylu kırmızı ışık (632.8 nm), kısa dalga boylu ışık kadar saçılmamaktadır. Detektör, başıboş ışıktan kaynaklanan paraziti en aza indirmek için iyi bir şekilde korunmalıdır. Maksimum hassasiyet için, özel nefelometreler düşük gürültülü fotoçoğaltıcı dedektörler kullanır.

Tam olarak oluşturulmuş antikor-antijen kompleksleri tarafından optimum dağılım için dalga boyu yaklaşık 460 nm’dir. Bununla birlikte, kinetik bağışıklık tahlillerinde, bağışıklık kompleksleri büyüdükçe optimum dalga boyunun değiştiği gösterilmiştir. Bu yaygın olarak kullanılan tahliller için, monokromatik ışık istenmez ve geniş bir bant (tipik olarak 450-550 nm) üzerinden gelen ışık, daha tekrarlanabilir tepe hızları sağlar.

Beckman Immage1, klinik laboratuvar nefelometresinin köklü bir örneğidir. Otomatik numune seyreltme, antiserum ekleme ve antijen fazlalığı kontrolü, bu tip özel analizörün özelliklerinden bazılarıdır. Işık sinyalinin elektronik farklılaşması, maksimum reaksiyon hızını belirlemek ve kaydetmek ve saklanan bir kalibrasyon eğrisi aracılığıyla bunu konsantrasyonla ilişkilendirmek için kullanılır.

Nefelometri veya türbidimetri

Genel olarak, nefelometri, türbidimetriden biraz daha hassas olma ve daha hızlı sonuç verme potansiyeline sahiptir. Öte yandan, türbidimetri özel bir dedektör gerektirmez ve fotometrik ölçüm kullanan şu anda mevcut olan birçok otomatik klinik analizörde gerçekleştirilebilir.

lüminesans

Lüminesans, bir elektron uyarılmış veya daha yüksek bir enerji seviyesinden daha düşük bir enerji seviyesine döndüğünde ışık veya radyan enerji emisyonudur. Floresan, fosforesans ve kemilüminesans dahil olmak üzere çeşitli lüminesans fenomeni türleri vardır. Lüminesans fenomeni, bir elektronun uyarılmış duruma nasıl aktive edildiğine göre farklılık gösterse de, benzer radyan enerji emisyonlarına neden olurlar.

floresan

Işık moleküler bir maddeye çarptığında, maddenin elektron konfigürasyonunu değiştirmesine ve bazı elektronları uyarılmış bir duruma getirmesine neden olmak için belirli bir dalga boyunda yeterli enerji emilebilir. Bu durum kısa ömürlüdür ve uyarılmış elektronlar hızla temel duruma geri döner.

Madde belirli bir kimyasal yapıya sahipse, geçiş çok aşamalı bir süreç olabilir ve ana adım, uyarı ışığından daha düşük enerjili yayılan ışığın salınmasıyla sonuçlanır. Temel duruma geçişteki diğer adımlar, çoğunlukla elektron çarpışmalarından kaynaklanan titreşimsel enerji kaybıdır.

Madde uyarılmış halden temel duruma geçerken üretilen yayılan ışığa floresans denir. Birçok molekül floresan (floroforlar) gösterir ve bu özellik hassas bir niceleme yönteminin temelini sağlar.

Genel olarak, floresan sergileyen bileşiklerin çoğu, ilişkili delokalize % elektronlar ile çoklu konjuge bağ sistemleri içerir. Yoğun bir şekilde floresan ışık veren çoğu florofor katı düzlemsel yapılara ve elektron veren gruplara sahiptir.

Seyreltik çözeltiler için, floresan yoğunluğu, floroforun konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. Absorpsiyon ve emisyon dalga boyu maksimumları da maddelerin tanımlanmasında faydalıdır. Uyarma ve emisyon dalga boyu maksimumu arasındaki fark Stokes kayması olarak bilinir ve kuantum verimliliği, yayılan ışığın miktarının bir ölçüsüdür.

Stokes kayması büyükse, gelen ışığın karışması olmadan yayılan ışığı ölçmek daha kolaydır. Ayrıca, kuantum verimliliği yüksekse, sinyal daha güçlüdür ve deney daha hassastır. Porfirinler için kan ve idrar analizi, floresansın kalitatif ve kantitatif kullanımına iyi bir örnektir.

The post Türbidimetreler – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).