Daha yakın zamanlarda, ENA’ya karşı antikorları tespit etmek için sandviç immünolojik testler geliştirilmiştir. Kısaca yöntem, antikor içeren hastanın serumunun, saflaştırılmış veya rekombinant bireysel ENA ile kaplanmış mikrotitre plaka kuyularına eklenmesini içerir. Antijene bağlanan antikorlar, bir enzim veya lüminesan molekül ile konjuge edilmiş bir poliklonal veya monoklonal anti-insan immünoglobulin antikorunun eklenmesiyle tespit edilir.

Hasta serumundaki antikor konsantrasyonu, renkli veya floresan ürünün yoğunluğu ile doğrudan ilişkilidir. Enzim immünolojik testleri, CIE veya çift difüzyondan daha duyarlıdır (analitik duyarlılık 1-10 ng/ml). Sonuç olarak, artan non-spesifik bağlanmanın bir sonucu olarak hipergamaglobulinemik serumlarda yanlış pozitif sonuçlar meydana gelebilir.

İmmünoblotlama

ENA’ya karşı antikorların saptanması için ek bir yöntem, nitel immünoblotlama tekniğidir (Western blot). Kısaca, bir nükleer özütten elde edilen antijenler, moleküler ağırlığa göre sodyum dodesil sülfat elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrılır.

Ayrılan antijenler daha sonra tek şeritler halinde kesilen ve hasta serumu ile inkübe edilen nitroselüloz kağıdına aktarılır (blotlama) (ayrı antijenlerle önceden kaplanmış ticari şeritler de mevcuttur). Bağlı antikorlar, şeritlerin enzim etiketli bir anti-insan immünoglobulin ile inkübe edilmesiyle saptanır.

Arthritis Foundation ve ABD Hastalık Kontrol Merkezleri tarafından yakın zamanda yürütülen bir kalite kontrol çalışmasında, önceden immünofloresan ve çift difüzyon ile karakterize edilen referans serumlarda anti-ENA özgüllüklerini yeniden analiz etmek için immünoblotlama kullanıldı.

Blotting nedir
Southern blot
Moleküler yöntemler
Southern blot yöntemi
Western blot nerelerde kullanılır
Moleküler Biyoloji Teknikleri
Transfeksiyon yöntemleri
Moleküler genetik yöntemleri nelerdir

İmmünoblotlamanın sonuçları, büyük ölçüde çift difüzyonla uyumluydu, ancak ek belirtilmemiş bantların raporlanmasıyla ilgili olarak bireysel laboratuvarlarda farklılıklar kaydedildi. Bu, bireysel laboratuvarlar tarafından kullanılan tekniklerdeki küçük farklılıklar nedeniyle immünoblotlama ile tanınan bir olgudur. İmmünoblotlama şu anda klinik immünoloji laboratuvarlarında rutin olarak kullanılmamaktadır.

Spesifikliği göz önüne alındığında, standart tahlillerle tutarsız sonuçlar veren hasta numunelerinin araştırılması için ayrılma eğilimindedir. Konvansiyonel analizlerin DNA ve ENA’ya karşı antikorları tespit edemediği, lupus veya lupus örtüşme bozukluklarının zorlayıcı klinik kanıtı olan bu nadir hastalarda, immünoblotlama, önceden karakterize edilmemiş antijenlere karşı antikorları tespit etme potansiyeli sunar.

NOT: İmmünoblotlamada ekstrakte edilebilir nükleer antijenlere karşı klasik antikor profilleri. Biodiagnostics Ltd.’nin izniyle değiştirilmiştir. SS-A ve SS-B, sırasıyla anti-Ro, La antikorları için alternatif terimlerdir. P1 ve P2, Ro’nun ayrı alt birimlerini ifade eder. Dahil edilen ilave antikorlar, anti-Scl 70 (skleroderma için belirteç), anti-Jo1 (interstisyel akciğer hastalığı olan polimiyozit belirteci), anti-PCNA (prolifere olan hücre nükleer antijeni; SLE vakalarının %2-10’unda görülür)

Çift sarmallı DNA’ya karşı antikorlar (anti-dsDNA)

Çift sarmallı DNA’ya (anti-dsDNA) karşı yönlendirilen antikorlar, özellikle böbrekte olmak üzere SLE’deki organ hasarının patogenezinde önemli bir rol oynamaktadır. Böbrek biyopsilerinin eluatlarında dsDNA ve IgG anti-DNA antikorlarının kompleksleri gösterilmiştir. Bu bulguya uygun olarak, anti-dsDNA antikorlarının seviyeleri SLE’deki genel hastalık aktivitesi ile iyi korelasyon gösterme eğilimindedir.

Çoğu hastada, serumdaki anti-dsDNA seviyelerindeki bir artış, bir hastalık alevlenmesinin habercisidir. Bazen, daha önce yükselmiş olan anti-dsDNA seviyelerindeki bir düşüş, muhtemelen böbrekte immün kompleks birikiminin bir yansıması olan lupus nefritinin habercisi olabilir.

dsDNA’ya karşı antikorlar, tedavi edilmemiş hastalığı olan hastaların %75-95’inde meydana gelen SLE için oldukça spesifik iken, tek sarmallı DNA’ya (ssDNA) karşı antikorlar spesifik değildir ve çeşitli başka hastalıklarda (romatoid artrit, kronik aktif hepatit, sağlıklı yaşlılar) lupusa ek olarak.

Algılama Yöntemleri

Anti-dsDNA’yı saptamak için mevcut birçok yöntemden çoğu klinik immünoloji laboratuvarı aşağıdaki üç testten birini kullanacaktır.

Farr tahlili

Farr tahlili, antijen olarak radyo-etiketli dsDNA’nın (125I yaygın olarak radyoizotop olarak kullanılır) kullanımını kullanır. 125I-dsDNA ile anti-dsDNA içeren test serumunun kuluçkalanması, doymuş bir amonyum sülfat çözeltisi kullanılarak çökeltilen bağışıklık komplekslerinin oluşumuna yol açar.

Anti-dsDNA miktarı, çökeltideki radyoaktivite miktarı ile doğru orantılıdır. Test numunelerindeki anti-dsDNA konsantrasyonu, bilinen miktarlarda antikor içeren bir referans standart serum varlığında 125I etiketli DNA miktarının ölçülmesiyle elde edilir.

Test standardizasyonu için Wo/80 olarak adlandırılan bir WHO standart serumu mevcuttur. Amonyum sülfat, düşük aviditeye sahip antikorlar içeren immün kompleksleri bozduğundan, Farr testi ağırlıklı olarak böbrek hastalığı ile ilişkili şiddetli lupus varlığı ile iyi korelasyon gösteren yüksek aviditeli antikorları saptar. Ancak Farr testi, nispeten hafif lupuslu hastalarda ortaya çıkan düşük aviditeli anti-dsDNA antikorlarını saptamaz.

ELISA

DNA antikorlarının saptanması için saflaştırılmış dsDNA’yı (rekombinant veya buzağı timus özünden) kullanan bir dizi ticari ELISA tahlili mevcuttur. dsDNA doğrudan plastik kuyulara bağlanmadığından, çoğu tahlil, mikrotitre plakalarını kaplamak için poli-L-lizin veya protamin ile komplekslenmiş DNA kullanır. Farr testinin aksine, ELISA testleri hem düşük hem de yüksek aviditeli DNA antikorlarını tespit eder.

Sonuç olarak, ELISA tahlili, teşhis amaçları için Farr tahlilinden daha yüksek bir hassasiyet derecesi sergiler; bununla birlikte, göreceli olarak daha düşük özgüllüğü, lupusu olmayan hastalarda önemli sayıda yanlış pozitif DNA antikor sonucunun üretilmesiyle sonuçlanır, örn. enfeksiyonlar, kronik karaciğer hastalığı.

Dolaylı immünofloresan kullanma

Crithidia luciliae Hemoflagellat Crithidia luciliae’nin büyük mitokondrisi (kinetoplast) neredeyse tamamen çift sarmallı DNA’dan oluştuğu için, Crithidia’yı antijen olarak kullanan dolaylı immünofloresan çalışmaları, anti-DNA antikorlarının saptanması için yüksek derecede duyarlılık ve özgüllük sergiler. 

Sabit C. luciliae içeren ticari slaytlar, uygun şekilde seyreltilmiş test serumu ile inkübe edilir, ardından floreseine konjuge anti-insan immünoglobulin antikoru eklenir. Kinetoplastla sınırlı floresan üreten numuneler pozitif olarak kabul edilir.

Ara sıra numuneler de nükleer floresan üretebilir, ancak çekirdek DNA’ya ek olarak birçok başka antijen içerdiğinden bu göz ardı edilmelidir. Bazı çalışanlar, kinetoplastın histonlar (DNA’ya bağlanan temel proteinler) içerebileceği ve anti-histon antikor pozitif serumda yanlış pozitif sonuçlara yol açabileceği endişesini dile getirse de, bu doğrulanmamıştır.

Histonlarla kontaminasyonun bir endişe kaynağı olduğu çoğu durumda, histonları ortadan kaldıran bir prosedür olan hidroklorik asit ile ön işleme tabi tutulmuş Crithidia lamlarında immünofloresan yapmak mümkündür. İmmünofloresan testlerin standardizasyonu ile ilgili zorluklar göz önüne alındığında, Crithidia testi antikor seviyelerinin seri izlenmesi için güvenilir değildir.

The post İmmünoblotlama – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

İmmünoblotlama ile küçük beyin örneklerinde bir gün içinde hızlı tanı elde edilebilir. Poliakrilamid SDS jelleri üzerinde ayrılan ve elektroforetik olarak nitroselüloz membranlara aktarılan proteinaz k-sindirilmiş doku, prion-spesifik antiserum ile reaksiyona giren 16-31 kDa moleküler ağırlıklı üç veya dört bant verir. Boyutları ve yoğunluk oranları, vCJD’yi sCJD’den ayırt edebilir. Bunlar Alzheimer hastalığında bulunmaz ve normal PrPc, proteinaz K tarafından tamamen sindirilir.

Diğer dokularda veya vücut sıvılarında testler

Şimdiye kadar tartışılan tüm yöntemler beyin dokusu üzerinde gerçekleştirilir. Teşhis, daha erişilebilir malzeme üzerinde daha basit olacaktır. PrPc’ye karşı monoklonal antikor, beyin dışındaki numunelerde proteaza dirençli PrP’yi tespit ederek CJD’yi teşhis etmek için kullanılabilir.

CJD hastalarının idrarında SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve proteinaz K ile sindirilmiş ultrasantrifüj topaklarının immünoblotlanması ile PrPR’ler tespit edilmiştir. Ayrıca formalinle sabitlenmiş gömülü bademcikler ve lenf düğümlerinde, deparafinizasyon, formik asit tedavisi ve hidrolitik otoklavlamadan sonra, biotin-avidin konjugatı kullanılarak, ancak sadece vCJD hastalarında saptanabilir.

Nöronal yıkımın vekil belirteçleri için beyin omurilik sıvısındaki testler artık CJD tanısı için kabul edilen repertuarın bir parçasıdır. En yaygın olarak kullanılan, 30 kDa yüksek oranda korunmuş nöronal protein 14-3-3’ü saptamak için tavşan poliklonal antikoru kullanan bir immünoblotlama tahlilidir.

Bu proteinin BOS’ta ortaya çıkması, bazı Alzheimer vakaları da dahil olmak üzere diğer nörodejeneratif hastalıklarda ortaya çıkabileceğinden, test sadece %88-95 spesifiktir. vCJD’ye (%50) sCJD’den daha az duyarlıdır, ancak aksonal mikrotübüler fosfoprotein olan tau için ticari bir ELISA ile birlikte test edilmesi vCJD duyarlılığını %86’ya kadar artırabilir.

Southern blot
Western blot
Blotlama nedir
Northern Blot yöntemi
Blotlama teknikleri
Moleküler yöntemler
Agaroz jel elektroforezi
Stacking jel Nedir

Non-invaziv teknikler

Elektroensefalografi, spesifik olmasa da genellikle faydalı olarak kabul edilir. Periyodik keskin dalga kompleksleri ve dış uyaranlara veya ilaçlara tepki gösterme belirgin gözlemlerdir. Tercih edilen mevcut görüntüleme testi, sCJD hastalarında %100 duyarlı ve spesifik olduğu iddia edilen bir belirteç olan multifokal kortikal ve subkortikal hiperintensiteler veren difüzyon ağırlıklı manyetik rezonans görüntülemedir (MRI).

Sonuç olarak, prion hastalığının doğası, tanıya yönelik olağan yaklaşımları ciddi şekilde sınırlar ve tanı genellikle yavaştır, invazivdir ve sıklıkla sadece otopside elde edilir. Bununla birlikte, vCJD, daha hızlı ve daha az invaziv teknikler için acil bir ivme sağlamıştır. 14–3–3 protein için CSF’yi test etmek şu anda mevcut ‘altın standarttır’ ve MRG’deki gelişmeler, non-invaziv tanı olasılıklarını iyileştirmiştir.

Antiviral duyarlılık testleri

Antiviral duyarlılık testleri, birçok rutin viroloji laboratuvarında henüz düzenli olarak yapılmamaktadır. Testlerin gerçekleştirilmesi birkaç gün veya hafta sürer ve bu nedenle yalnızca, aksi takdirde çok ciddi klinik problemler için uzun terapiye ihtiyaç duyan hastalara fayda sağlayabilir.

Muhtemelen insan immün yetmezlik virüsü (HIV) antiviral direncini izlemek veya bu hastalarda dirençli Herpes grubu virüslerini tanımlamak için çok sayıda bağışıklığı baskılanmış hastayla ilgilenen laboratuvarlarda ortaya çıkmaları daha olasıdır.

Uygulamada, antiviral tedaviyi değiştirme kararları genellikle deneysel direnç kanıtlarına, yani klinik olarak yanıt vermemeye dayanır. Alternatif olarak, viral antijenin başarısızlığı veya kandaki nükleik asit seviyelerinin tedaviye yanıt olarak düşmemesi gibi vekil direnç sınırları ölçülür.

Gerçek duyarlılık tahlilleri iki kategoriye ayrılır: antiviralin virüs büyümesi üzerindeki etkisini in vitro olarak ölçen fenotipik; ve direnç sağlayan mutantların varlığını doğrudan tespit eden genotipiktir.

Fenotipik tahliller

Fenotipik testler, antiviral direncin kesin kanıtını sağlar. Kültür hücreleri üzerindeki virüs büyümesinin genel sitopatik etkisini (CPE) veya viral metabolizmanın belirli aşamalarını, yani, inhibe etmek için gereken antiviral konsantrasyonu ölçerler. DNA veya protein sentezidir.

Virüsün önce doku kültüründe yayılması gerekir; bu adım, daha sonra test edilen dirençli mutantların oranını değiştirerek sonucu karıştırabilen bir adımdır. Bu nedenle testler tercihen düşük geçişli izolatlar üzerinde yapılır. HIV sıklıkla periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC) bir lenfoblastoid hücre dizisi ile birlikte kültür yoluyla izole edilir, bu da ilave bir başka komplikasyondur.

Plak azaltma (PR) testleri

Hücre tek tabakaları, virüs hareketini sınırlayan koşullarda, yani katı bir agar veya selüloz kaplaması veya antiviral immünoglobulin içeren sıvı altında seyreltilmiş virüs ile tohumlandığında, her virüs plağı oluşturan birim (pfu) ayrı bir CPE plakı üretir.

Sabit titre edilmiş virüs miktarları (15-500 pfu) ile birlikte seri olarak seyreltilmiş antiviralin eklenmesi, %50 plak azalmasına (ID50) neden olan konsantrasyon olarak antiviral duyarlılığın ölçülmesini sağlar.

PR testleri sadece izolatın %20-25’inden fazlasını oluşturan dirençli suşları tespit eder. %90 plak azaltma eşiği kullanılarak daha düşük oranlar tespit edilebilir, ancak ID90 ölçümleri ID50’den daha az doğrudur.

PR tahlilleri nispeten ucuz rutin kültür teknikleri kullanır, ancak dezavantajlar, kullanılan reaktiflerin, ortam ve virüsün hacimleri ve hücre, virüs ve antiviral konsantrasyonları standardize etmek ve kopya kültürlerdeki plakları manuel olarak saymak için gereken süredir.

Genel test süresi en az 2 haftadır. Virüs:hücre oranı, oranlar sırasıyla çok düşük veya çok yüksek olduğunda hatalı olarak yüksek veya düşük duyarlılık tahminleri oluşturmaktan kaçınmak için optimize edilmelidir.

Ön Herpes simpleks (HSV) duyarlılık sonuçları, izolatların enfektivitelerinin titrasyonuna paralel olarak ön tarama yapılarak, kabul edilen direnç eşik konsantrasyonunun 1,5 katında asiklovirli ve asiklovirsiz seri viral dilüsyonların inkübasyonu ile 3 günde elde edilebilir.

PR testleri HSV, sitomegalovirüs (CMV) ve Varicella zoster (VZV) direncinin saptanması için altın standarttır. Kabul edilen direnç eşikleri belirlenmiştir: asiklovir için 2 mg/ml, foscarnet için 100 ml/ml ve gansiklovir için tedavi öncesine kıyasla ID50’de üç ila dört kat artış vardır.

Bununla birlikte, ilgili uzun prosedürler ve düşük izolasyon oranları, sıklıkla %30 kadar düşük, HIV PR tahlillerini daha hızlı genotipik tahlillere göre klinik olarak daha az kullanışlı hale getirir.

The post İmmünoblotlama – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).