Mikro ölçekli ayırma teknolojilerinin evrimi, CE-SDS gibi kılcal tabanlı tekniklerin, proteinlerin ve antikorların hidrodinamik boyutunu belirlemek için SDS-PAGE’nin yerini almasına izin verdi. CE-SDS, değiştirilebilir polimer jel matrisi ile doldurulmuş bir kapiler ve ayırma için yüksek voltaj uygulaması kullanır.

Cihaz, kontrollü bir ortamda otomasyona izin vermek için genellikle bir çevrimiçi otomatik örnekleyici, güç kaynağı ve bir UV / foto diyot dizisi (PDA) algılama sistemi içerir. SDS-PAGE ile karşılaştırıldığında, CE-SDS, gelişmiş çözünürlük, daha fazla doğrusal aralık ve son derece düşük kimyasal atık gibi çeşitli avantajlar sunar ve en önemlisi, kılcal absorbans tespiti niceliksel analiz sağlar.

Kapiler şartlandırma, numune enjeksiyonu, ayırma, entegrasyon ve rapor oluşturma dahil tüm süreç tamamen otomatikleştirilebilir.

Protein ayırma için CE-SDS yöntemleri genellikle hem indirgenmiş (genellikle b-merkapto etanol, BME gibi bir indirgeyici madde kullanılarak) hem de indirgenmemiş koşullar altında (genellikle iyodoasetamid (IAM) veya N-etilmaleimid (NEM SDS-PAGE gibi, CE-SDS de yüksek sıcaklıkta SDS numune tamponu kullanarak molekülleri denatüre eder.

Bir CE-SDS yönteminin geliştirilmesi aşağıdaki beş adımı içerir:

• (1) proteinlerin tamamen denatüre olmasını ve / veya azaltılmasını sağlamak için numune hazırlama koşullarının belirlenmesi,
• (2) analiz doğrusal aralığının belirlenmesi,
• (3) aşağıdaki gibi ayırma parametrelerinin optimizasyonu Çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak için ayırma voltajı ve sıcaklığının yanı sıra kılcal iç çap (ID) ve uzunluk (L) çalışmaları,
• (4) hassasiyeti en üst düzeye çıkarmak için en iyi dedektör tipinin belirlenmesi ve
• (5) veri için bir veri işleme yönteminin geliştirilmesi analizi.

1. Örnek Hazırlama

Biyofarmasötik analizde tipik bir numune hazırlama yaklaşımı şöyledir: 150 mg’lık bir protein veya antikor bölüntüsüne 3 mL dahili standart (IS, 10 kDa moleküler ağırlık işaretçisi, SDS-MW Analiz Kiti, Beckman Coulter, Fullerton, CA), 10 mL ekleyin indirgenmemiş CE-SDS (nrCE-SDS) için indirgenmiş CE-SDS veya 10 mL 250 mM IAM için düzgün BME ve SDS numune tamponu (SDS-MW Analiz Kiti, Beckman Coulter, Fullerton, CA) ile QS toplam hacim 150 mL. IAM genellikle taze olarak hazırlanır. Karışımı vorteksleyin ve sıvıyı tüpün dibine getirmek için kısa süre santrifüjleyin.

75 ° C’de 10 dakika su banyosu kullanarak tüpü ısıtın. Çözeltiyi oda sıcaklığına soğutun, sıvıyı tüpün dibine getirmek için kısa süre santrifüjleyin ve çözeltiyi karıştırmak için tekrar vorteksleyin. Çözelti artık enjeksiyona hazırdır. Şekil 1’de bir numune hazırlama akış diyagramı gösterilmektedir.

Denatürasyon için gereken ısıtma sıcaklığı ve süresi molekülün özelliklerine bağlıdır ve bu nedenle her bir biyomolekül için optimize edilmelidir.

Sodyum Dodesil sülfat ne ise yarar
Sodyum dodesil sülfat ne ise yarar
Sodyum dodesil sülfat Nedir
Sodyum Dodesil Benzen sülfonat
Sodyum Lauril Sülfat
Sodyum dodesil sülfat Poliakrilamid jel elektroforezi
Sodyum Dodesil Sülfat fiyat
Sodyum dodesil sülfat deterjan

2. CE-SDS’de Ayırma Koşulları

Ayırma koşulları, kılcal uzunluk (L), kılcal ID, ayırma gerilimi (V) ve ayırma sıcaklığı (T) açısından optimize edilebilir.

Şekil 2, kısa bir kılcal (33.0 cm toplam) ve bir uzun kılcal (toplam 48.5 cm) kullanılarak bir proteinin CE-SDS ile ayrılmasının sonuçlarını göstermektedir. Uzun kılcal damar kullanılarak yapılan analiz daha fazla zaman alır ve azalmış hassasiyet gösterir. Daha kısa analiz süresi gerektirdiği ve daha iyi hassasiyet ürettiği için genellikle kısa kapiler tercih edilir.

Ayırma gerilimi, yöntem geliştirme sırasında çözünürlüğü optimize etmek için bir başka önemli parametredir. Şekil 3, ayırma için farklı voltajlar uygulanarak elde edilen elektroferogramların (e-gram) bir örneğini göstermektedir. Daha yüksek ayırma voltajı, daha iyi çözünürlükle daha hızlı bir ayırma sağlar; ancak dalgalı bir taban çizgisi gözlemlendi. Bu durumda, uygun temel stabilite ve profil çözünürlüğü için 15 kV seçilmiştir.

Molekül ayrışması üzerinde de önemli bir etkisi olabilen kılcal sıcaklığın etkisi Şekil 4’te gösterilmektedir. Daha yüksek bir sıcaklık daha hızlı göç sağlar; ancak, aynı zamanda temel kararsızlığa da neden olur. Tavsiyemiz 202251C kullanılmasıdır.

Hidrodinamik enjeksiyon, elektrokinetik enjeksiyonla karşılaştırıldı (veriler gösterilmemiştir). İki enjeksiyon modu, karşılaştırılabilir yüzde tepe alanları verdi. Elektrokinetik enjeksiyon, hidrodinamik enjeksiyona kıyasla biraz daha yüksek çözünürlük verdi. CE-SDS yöntemi için genellikle elektrokinetik enjeksiyon önerilir.

Genel olarak proteinler ve antikorlar için önerilen CE-SDS ayırma koşulları aşağıdaki gibidir:

• Kılcal uzunluk
• Kapiler iç çap (ID)
• Ayırma gerilimi
• Kılcal sıcaklık
• Enjeksiyon voltajı
• Enjeksiyon zamanı

3. CE-SDS’de Veri Analizi

Ana protein türlerinin yüzdesini hafif zincir ve ağır zincir (% LC ve% HC) ve ana olmayan yüzde ve yüksek molekül ağırlıklı türler (% ana olmayan türler ve% HMW) gibi küçük türleri ölçmek için bir antikor için elektroferogramın entegrasyonu Şekil 5’te gösterilmektedir. Düzeltilmiş tepe alanları niceleme için kullanılmıştır. Düzeltilmiş pik alanı yüzdesi olarak tanımlanır.

4. CE-SDS Yeterliliği

(a) Enjeksiyon Doğrusallığı:

Daha önce belirtildiği gibi, enjeksiyon koşulları değişen enjeksiyon süresi ve enjeksiyon voltajı ile optimize edilebilir. Şekil 6A, indirgenmiş bir CE-SDS yöntemi için 􏰔5kV’lik bir enjeksiyon voltajında ​​enjeksiyon süresine karşı pik alanının doğrusal çalışma grafiğini göstermektedir.

Bir enjeksiyon doğrusallık çalışması yapmanın avantajı, deney doğrusallık aralığı içinde büyük ve küçük protein türlerini niceleme yeteneği için yöntemi optimize etmek ve nitelendirmektir. Dahili standart (IS), LC ve HC, Şekil 5 ve 6A’da taban çizgisi çözümlendi. Bu yöntem, bu ana türlerin SDS-PAGE yönteminden (Şekil 6B) daha yüksek çözünürlüğünü sağlar.

Şekil 7, ana olmayan türler olarak adlandırılan HC, LC ve HC olmayan ve LC türler için enjeksiyon süresine karşı çizilen düzeltilmiş tepe alanı sonuçlarını gösterir. Düzeltilmiş tepe alanı değerleri, detektörden geçerken farklı moleküler boyuttaki türler arasındaki hız farklılıklarını telafi ettikleri için kullanılır. Bu sonuçlar, indirgenmiş CE-SDS yönteminin, HC, LC ve ana olmayan türler için geniş bir enjeksiyon doğrusallık aralığına (􏰔5 kV’de 5􏰔40 s) sahip olduğunu göstermektedir.

Saflığın belirlenmesinde kullanılacak azaltılmış CE-SDS yönteminin yeteneğini daha da doğrulamak için, düzeltilmiş toplam pik alanına göre her bileşen için yüzde düzeltilmiş pik alanı (% HC,% LC ve% ana olmayan) hesaplandı . Şekil 8,% HC,% LC,% ana olmayan türler ve enjeksiyon süresi arasındaki ilişkiyi göstermektedir.

The post Elektroforez-Sodyum Dodesil Sülfat – Farmasötik Analiz İçin Kapiller Elektroforez Yöntemleri – Ayırma Teknolojisi – FARMASÖTİK ANALİZ – Kimya Mühendisliği – Ayırma Teknolojisi Ödevleri – Kimya Mühendisliği Ödev Yaptırma – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).