VWF’nin Multimerik Analizi

1981 yılında, Ruggeri ve Zimmerman tarafından VWF:Ag multimerlerinin yüksek çözünürlüğü için indirgeyici olmayan bir SDS-jel elektroforezi rapor edilmiştir. Bu orijinal yöntem o zamandan beri başkaları tarafından değiştirildi ve geliştirildi, ancak yöntemin ilkesi aynı kaldı.

Modifikasyonlar, asıl yöntemdeki varyasyonları, proteinin ayrıldığı ortamın tipini, yarı otomasyonu ve farklı tipte antikorları ve multimer bantlarının görselleştirme yöntemlerini içerir.

Bu yöntemlerin tümü, yüksek ve/veya orta moleküler ağırlıklı multimerlerin kaybının olduğu varyant veya tip 2 VWD’de görülenler gibi VWF:Ag kalitatif anormalliklerinin tanımlanması için kullanılır.

Tip 2 VWD tanı ve sınıflandırmasında kullanılan VWF:Ag’nin kapsamlı multimer analizi için, hem plazma hem de trombosit VWF:Ag, %1.0-2.2 agaroz jel konsantrasyonlarında incelenmelidir. Burada açıklanan yöntem, Enayat ve Hill’in (1983) orijinal Ruggeri ve Zimmerman (1981) yönteminin modifikasyonudur.

Bu, süreksiz bir tampon tekniği kullanan bir SDS-agaroz jel elektroforezidir. Multimer bant görselleştirmesi, 125I etiketli bir mono- veya poliklonal anti-VWF antikoru kullanılarak otoradyografi ile yapılır. Agaroz jellerden multimer bantlarının farklı tipteki dolgu maddelerine aktarılmasından sonra bant görselleştirmesi için diğer radyoaktif olmayan yöntemler de mümkündür.

Alfa heliks yapısı
Protein katlanması PDF
Protein katlanması nedir
Proteinlerin katlanması
Proteinlerin alfa heliks yapısı
Globüler proteinler
Alfa heliks yapısı nedir
Yapısal proteinler

Jel Hazırlama

Jelleri hazırlamak için, bir cam plakayı kaplayan ve ikinci bir cam plakadan 1 mm kalınlığında U-şekilli bir plastik ayırıcı ile ayrılan bir jel bağ film parçasından (Flowgen) yapılmış bir sandviç seti kullanılır.

Çalışan jel (Agaroz Tip VII LGT; Sigma) cam plakaların arasına dökülür ve sertleştikten sonra üst cam plaka çıkarılır ve jelin tepesinden 3 cm’lik bir şerit kesilir ve yerine istifleme yapılır. %0,8 agarozdan oluşan jel (SeaKem HGT (P) Agarose, Flowgen Instruments Ltd).

Numune kuyuları istifleme jelinde kesilir. Test edilecek numuneler, moleküler migrasyonun izlenmesi için bromofenol mavi boya ve VWF moleküllerinin tam dağılımı için sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren ve tüm multimerlere negatif yük sağlayan bir tampon içinde 56°C’de 30 dakika süreyle inkübe edilir. 

Elektroforetik Koşullar

Her elektroforez aletinin bu yöntem için optimize edilmesi gerekir, ancak genel olarak, numunelerin kuyulardan istifleme jeline hareket etmesi için elektroforez başlangıçta 2 mA/cm hızla gerçekleştirilir. Boş kuyucuklar, erimiş istifleme jeli ile doldurulur ve elektroforez, gece boyunca 1.0 mA/Cm’lik daha düşük bir hızda gerçekleştirilir.

Elektroforez tamamlandığında jeller izopropanol solüsyonunda sabitlenir, preslenerek kurutulur ve %10 tavşan serum solüsyonunda yıkanır. Otoradyografi, jellerin 125I etiketli anti-insan VWF antikoru (DAKO Ltd) içinde gece boyunca inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir.

Reaksiyona girmemiş antikoru ayrıştırmak için kapsamlı bir yıkamadan sonra, jeller kurutulur ve X-ışını filmleri kullanılarak otoradyograf plakaları üretilir ve geliştirmeden önce 2-5 gün boyunca 70°C’de tutulur.

Sonuçların Yorumlanması

Otoradyografi son derece hassas bir yöntemdir ve maruz kalma miktarı değiştirilerek aynı jelden farklı yoğunluklarda farklı otoradyografiler elde edilebilir. Plazmadaki normal VWF:Ag modeli, von Willebrand Faktörünün multimer bantlarının tüm aralığını gösterir. Bunlar yüksek, orta ve düşük moleküler ağırlıklı multimerlerden oluşur.

Her multimer bandı, ana merkezi ve iki soluk fakat eşit derecede boyanmış uydu bantları (a ve b) olmak üzere bir üçlü banttan oluşur. VWF:Ag multimerlerinin en iyi yayılımı orta çözünürlüklü (%1.3-1.5) agaroz jelde görülür, yüksek moleküler ağırlıklı multimerlerin kaybı en iyi düşük çözünürlüklü (%1.0-1.3), agaroz jellerde ve üçlüde araştırılır. yüksek çözünürlüklü (%1.8-2.2) agaroz jellerde bant anormallikleri de vardır.

Bu nedenle, tam bir multimerik analiz için iki veya üç farklı jel konsantrasyonu kullanılmalıdır. Bu kolay bir teknik değildir ve her çalışma diğerinden farklılık gösterebilir ve elektroforetik koşulların bireysel optimizasyonunu gerektirebilir. Her multimer modelinin dansitometrik analizi, bazı tip 2A VWD hastalarında multimer kazancı veya kaybı miktarının ölçülmesine de yardımcı olabilir.

Normal trombosit VWF:Ag multimer bantları plazmadan görülenlerden farklıdır. Trombositlerde plazmadan çok daha büyük multimerler bulunur ve multimerik organizasyon da farklıdır.

Daha küçük multimer bantları bir ikiliden oluşuyor gibi görünmektedir ve merkezi bantlar plazmadaki karşılık gelen multimerlerden daha az göç eder. Trombosit multimer analizinden elde edilen bilgiler, bazı tip 2A VWD hastalarının tedavi tipine karar vermede yardımcı olabilir ve bu hastalarda mevcut mutasyon tipine de karşılık gelir.

Ristosetin Kaynaklı Trombosit Agregasyon Testi (RIPA)

VWF glikoproteininin ana işlevlerinden biri, trombosit membranı GPIb-IX reseptör kompleksindeki GPIb ile etkileşim yoluyla vasküler yaralanma bölgesinde subendotelyuma trombosit yapışmasını teşvik etmektir. VWF’nin A1 alanına eşlenen bu fonksiyonel alan, birincil hemostazda önemli bir rol oynar.

Bu alandaki kusurlar, VWF’nin trombosit GPIb’ye ​​afinitesinde artışa neden olur. Ancak bu tromboza neden olmaz, paradoksal olarak kanamaya neden olur. Tip 2 VWD’nin bu nadir fenotipi, tip 2B olarak adlandırılır ve karakteristik fonksiyonel anormalliği, ristosetin ile indüklenen trombosit agregasyon testi (RIPA) ile de tespit edilir.

Antibiyotik ristosetin, VWF’nin trombositten zengin plazmada (PRP) trombosit GPIb’ye ​​bağlanmasını indükler ve farklı ristosetin konsantrasyonları ile trombosit aglütinasyon derecesi bu tahlilin temelini de oluşturur.

Bu anormalliğin yanı sıra, 2B VWD, VWF:Ag’nin multimerik analizi ile tanımlanan plazmada yüksek moleküler ağırlıklı multimerlerin (HMWM’ler) seçici olarak yokluğu ile de karakterize edilir. Aslında, tip 2B VWD’li hastalar, trombositler ve endotelyal hücrelerdeki normal multimerik VWF:AG multimer paternleri ile gösterildiği gibi, VWF multimerlerinin tamamını sentezleyebilir, ancak anormalin artan afinitesi nedeniyle HMWM’ler dolaşımdan temizlenir. Trombosit GPIb reseptörü için VWF de kullanılır.

Burada açıklanan RIPA metodolojisi, 1977’de açıklanan orijinal çalışmanın bir modifikasyonudur. Ristocetin (Paesel-Lore), Trisbuffered salin, pH 7.4 ve beş farklı solüsyonda sulandırılarak 0.50, 0.1, 0.125 ve 0.15 mg/ml nihai konsantrasyonlar elde edilir, tahlilde kullanılmak üzere de hazırlanmıştır.

The post Multimerik Analizi – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).