Bu bölümde aşağıdaki bölümlerdeki bileşenleri ele alacağız:

• nükleosit bazları,
• nükleositler,
• nükleotidler ve
• polinükleotidler (RNA ve DNA)

Doğal nükleosit bazları, beş heterosiklik aromatik bileşikten biri olabilir ve adenin, guanin (pürinler), sitozin, timin ve urasili (pirimidinler) içerir. Nükleositler, aromatik halka nitrojen atomlarından biri aracılığıyla bir karbonhidrat kısmına bağlanan bir bazdan oluşur.

Spesifik karbonhidrat, RNA’yı (riboz) DNA’dan (deoksiriboz) ayırır. Nükleotidler, nükleositlerin fosforile türevleridir ve 5 ’konumunda veya 3’ konumunda bir, iki, size veya (daha az yaygın olarak) dört veya daha fazla fosfat kalıntısı içerir.

Bu bileşiklerin ayrılması için yaygın olarak kullanılan üç HPLC modu arasında iyon değişimi, ters faz ve ters fazlı iyon çifti bulunur. PK, bazların ve nükleositlerin değerleri, tüm kromatografik modlarda tutulma sürelerinin belirlenmesinde önemli bir rol oynar ve referans için bir liste sunulur (pK ,, ve pK ,, ilk kazanıma ve bir protonun ilk kaybı). Kimyasal olarak modifiye edilmiş bir dizi nükleosit türevinin önemli biyolojik işlevleri vardır ve bu bileşiklerin birkaçı viral enfeksiyonların ve kanserin tedavisi için kullanılır; bunlar da bu bölümde tartışılacaktır.

 Örnek Hazırlama

Biyolojik kaynaklardan nükleositlerin ve nükleotitlerin ekstraksiyonu geleneksel olarak buz soğukluğunda perklorik asit (veya daha az sıklıkla trikloroasetik asit) içinde homojenleştirme ile gerçekleştirilir. Bu, proteini numuneden çökeltme, nükleotitleri süpernatanda bırakma ve daha sonra santrifüjlemeden sonra çıkarılabilme avantajına sahiptir.

Süpernatan, sulu bir hidroksit veya bir amin-freon çözeltisi gibi bir alkali çözelti ile nötrleştirilebilir. Daha yeni teknikler, kimyasal modifikasyon potansiyelini ortadan kaldıran ultrafiltrasyon ile proteinin uzaklaştırılmasını içerir. Alternatif olarak, deproteinizasyon, buz gibi soğuk asetonitril ile işlemden geçirilerek gerçekleştirilebilir.

Molekülün karbonhidrat kısmının kimyasal özelliklerindeki farkı kullanarak deoksiribonükleositleri ribonükleositlerden ayırmak mümkündür. Periyodik çözelti spesifik olarak ribonükleositlerdeki cis-diol fonksiyonu ile reaksiyona girecek ve bunların etkili bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlayacaktır.

Alternatif olarak ribonükleositler, bazik pH’ta Affi-Gel 601 gibi bir boronat jel kolonuna spesifik olarak bağlanabilir ve daha sonra 0.1 M formik asit ile ayrıştırılabilir.

Pirimidin bazları
Nükleik asit
Nükleotit yapısı
Nükleotid Nedir
Nükleotit dizilimi
Adenin nükleotidi
DNA yapısı
Nükleotit çeşitleri

Zirvelerin Karakterizasyonu

Nükleozid eluent piklerinin tanımlanmasına yönelik klasik yöntemler, referans bileşiklerle tutma süresi veya “spiking” (ortak kromatografi) kullanmaktır. Ek olarak, ikinci bir kromatogramdan kaybedilen zirveleri gözlemleyerek ribonükleositleri tanımlamak için periodat ile kimyasal işlem kullanılabilir. Benzer şekilde enzimatik modifikasyon, birkaç özel durumda faydalı olabilir.

Substrat pikinin alanındaki kayıp veya azalma veya ürün pikinin alanındaki artış, bileşik tanımlamasına yardımcı olur. UV soğurma oranı (A254 / A280), bileşik tanımlama için alternatif bir yol sağlar. Bazı karakteristik oranlar verilmiştir.

Biyolojik kaynaklardan elde edilen nükleosit türevleri genellikle çok düşük seviyelerdedir ve bu sadece UV saptamanın hassasiyeti için değil, aynı zamanda tanımlama amaçları için de ciddi bir problem olabilir.

Kloroasetaldehit, 410 nm’de maksimum emisyona sahip oldukça flüoresan bir türev olan 1, N6-etenoadenin üretmek için adenin ve ilgili bileşiklerle oldukça spesifik bir reaksiyona girer. Bu yöntem, 1 pmol adenin ve ilgili nükleositlerin ve nükleotitlerin spesifik tespitine izin verir.

Nükleosit Bazları

Nükleik asit bazları genellikle karşılık gelen nükleositlerin varlığında analiz edilir, çünkü tercih edilen kromatografik modlar her iki bileşik sınıfının aynı anda ayrılması için uygundur. Başlangıçta nükleosit bazlarının polar karakterinden iyon değişimli HPLC kullanılarak yararlanılmıştır; bununla birlikte, ters faz teknikleri artık daha yaygın olarak kullanılmaktadır.

Nükleosit bazlarının, nükleositlerin ve diğer UV emici bileşiklerin ayrılmasına yönelik kromatografik tekniklere ilişkin en kapsamlı araştırmalardan ikisinde, ters faz kolonundaki 86 bileşiğin alıkonma verileri hem nitelik hem de nicelik olarak rapor edilmiştir.

Sulu bir fosfat tamponu-metanol gradyanı kullanılarak tek bir ODS kolonunda 28’e kadar bileşiğin mükemmel ayrılması elde edildi. Pürin ve pirimidin serilerinde kimyasal yapı ile alıkonma süresi arasında bir ilişki gösterilerek, tutma süresinin kimyasal yapıdan tahmin edilmesine izin verildi.

Çeşitli biyolojik sıvılardaki purin ve pirimidin metabolitlerinin konsantrasyonlarının doğru belirlenmesi, bir dizi hastalık durumunun çalışılmasına izin verir ve terapötik yaklaşımlar önerebilir. Ters fazlı kromatografiyi kullanarak, nükleosit bazlarını, nükleositleri ve nükleotitleri tek bir kromatografik çalışmada ayırmak mümkündür.

Örnekler idrar, serum ve plazma gibi fizyolojik sıvılardan elde edildi. İdrar doğrudan filtrasyondan sonra kullanıldı, ancak serum ve plazma örnekleri önce perklorik asit ile çökeltilerek deproteinize edildi ve ardından enjeksiyondan önce nötralize edildi.

HPLC ayrımı, 0,05 M fosfat tamponu (pH 5,6) ile başlayıp 0,05 M fosfat tamponu (pH 5,6) -metanol-su ile biten bir kademeli üçlü çözücü gradyanı kullanılarak bir ODS durağan fazı üzerinde test bileşikleri ile geliştirilmiştir.

Bu tekniğin Lesch-Nyhan sendromlu bir hastadan alınan idrar örneklerine uygulanması gösterilmektedir. Yıkanan bileşenler, 254 nm ve 280 nm’de bir UV detektörü ile izlendi ve her bileşenin 5-10 pmol saptanmasına izin verdi. Radyo-etiketli öncüllerin metabolik kaderi, bir radyoaktivite detektörü kullanılarak izlenebilir.

5-florourasilin dahil edildiği benzer bir örnek, nükleosit bazlarının ayrılması için sulu fosfat tamponları ile birleştirilmiş ters fazlı sistemlerin geniş uygulanabilirliğini göstermektedir.

Bu çalışma aynı zamanda, farklı izokratik koşullarla kombinasyon halinde dokuz farklı analitik ters faz kolonunun yararlı bir karşılaştırmasını içerir ve aralarındaki ince farklılıkları açıkça gösterir.

Çalışma, test bileşiklerinin çözünürlüğünü maksimize etmek için en iyi sabit fazın, seçici tampon olarak amonyum fosfat ile kombinasyon halinde Spheri-sorb ODs-2 olduğu sonucuna varmıştır.

The post Nükleosit Bazları – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

Sıralı filtrelerin dahil edilmesiyle kromatografik kolonu partikül maddeden koruma ihtiyacı halihazırda tarif edilmiştir, ancak kolonun bazı çözünür bileşenlerden korunması için eşdeğer bir ihtiyaç da vardır.

Genellikle bu malzemeler numune hazırlama aşamasında çıkarılır; ancak ek bir önlem olarak sisteme bir koruma sütunu dahil edilebilir. Koruyucu sütunlar ana sütundan daha küçüktür.

Genellikle ana sütundakine benzer bir malzeme ile paketlenirler ve aksi takdirde ana sütunu tıkayabilecek çok yüksek k ‘değerlerine sahip bileşikleri etkin bir şekilde kaldırırlar. Koruyucu kolonlar, nispeten düşük maliyetleri nedeniyle sık sık değiştirilebilir ve böylece ana kolonun ömrünü uzatır. Koruyucu kolonların, kolon dışı bant genişleme etkilerine katkıda bulunarak kolon performansında bir bozulmaya neden olabileceği unutulmamalıdır ki bu açıkça da en aza indirilmelidir.

Mobil fazlarda kullanılan solvent, kolon destek materyalini yavaşça çözerek kolon performansında aşamalı bir kayba neden olabilir. Bu, 8’in üzerindeki pH değerlerinde çalışan silika bazlı sabit fazlarda yaygın bir sorundur.

Desteğin çözülmesi, kolon boşluklarının görünmesine neden olur ve performans kaybına neden olur. Bu problem, numune enjeksiyon noktasından yukarı akıştaki ana kolon ile aynı sabit fazı içeren küçük bir kolonun konumlandırılmasıyla durağan fazın önceden doyurulmasıyla aşılabilir.

Sütun Depolama

Sütunlar genellikle saf bir çözücü içinde, sütunun uçları sıkıca kapatılmış olarak saklanmalıdır. İyon çifti reaktifleri veya tamponları kullanılmışsa, korozyon olasılığını önlemek için bunlar kolondan en az 50 kolon hacmi ile iyice yıkanmalıdır.

Nükleotit çeşitleri
Nükleotit nükleozit farkı
Nükleotitler
Nükleik asit nedir
Nükleotit nedir
Nükleotit isimleri
Nükleik asit yapı taşı
Nükleotit yapısı

Hortum

Ara bağlantı borusunun ve bağlantı parçalarının hacmi, ekstra kolon bandı genişlemesine katkıda bulunur ve bu nedenle en aza indirilmelidir. Genel olarak, iç çapı 0,5 mm olan 1/16 inç çelik kılcal boru kullanılır, ancak 0,3 mm veya 0,2 mm iç çapa sahip borularla iyileştirilmiş bir performans elde edilebilir.

Swagelok sistemi gibi boru konektörlerinin kullanımında dikkatli olunmalıdır çünkü bağlantı her çözüldüğünde, daha sonra yeniden mühürlemek için biraz daha fazla güç gerekir. İlk etapta sürekli açma ve yeniden sıkma veya aşırı sıkma çözücü akışını ciddi şekilde bozarak yüksek geri basınçlara neden olabilir.

Bir contanın elde edilmesinin zor olduğu yerlerde PTFE bandı Swagelok bağlantı parçalarının etrafına sarılabilir. Ayrıca, bu konektörler içinde boşluklar oluşturmamak da önemlidir, çünkü bunlar ekstra sütun bant genişlemesini önemli ölçüde de artırabilir.

Bu tür boşluklara neden olan ana suçlu, zayıf boru uçlarıdır ve bunlar her zaman temiz ve dik olarak kesilmeli ve ardından ince bir korindon taşı ile düzeltilmelidir. Hortum daha sonra ultrasonik işlemden geçirilmeli, yıkanmalı ve metal tozları gidermek için de kurutulmalıdır.

Tespit etme

Çeşitli dedektör türleri, enstrümantasyon bölümünde açıklanmaktadır ve özel dedektör seçimi, bu bölümde açıklanan bir dizi kritere bağlı olacaktır. Bununla birlikte, genel performansı etkileyebilecek bir dizi genel noktadan da bahsedilmelidir:

(a) En yüksek genişletme etkileri, içsel detektör hücre hacminden ve bağlantı tüplerinden kaynaklanabilir. Bu nedenle, dedektör hücre hacmi, maksimum hassasiyeti koruyan bir seviyeye indirilmelidir.
(b) Yanıt süresi, dedektör çıktısının gerçek kromatografik elüatı yansıtmasına izin verecek kadar hızlı olmalıdır.
(c) Bileşik tespit edilebilirliği. İlgilenilen bileşiğin detektör tarafından tespit edilebileceğinin belirlenmesi önemlidir. Bu, bileşiğin fizikokimyasal özelliklerine bağlı olacaktır.
(d) Algılama hassasiyetini iyileştirmek için arka plan gürültüsü en aza indirilmelidir (özellikle iz analizi için). Elektriksel olarak ‘gürültülü’ ortamlar için şebeke voltajı tepe düzeltme cihazları da önerilir.

Tepe Tanımlama

Tutulma süresi ve referans bileşiklerle birlikte kromatografi, pik tanımlama için çok yararlı bir kılavuzdur, ancak daha fazla onay gerektirir ve bu amaç için aşağıdakileri içeren bir dizi yöntem kullanılmıştır:

(a) Kimyasal veya fiziksel karakterizasyon (örneğin, kütle spektrometrisi). (b) UV soğurma oranları.
(c) Durdurulmuş akış UV / floresan taraması.
(d) Enzimatik tepe kayması.
(e) Türevlendirme.

Bu çeşitli yöntemler, ayrı ayrı veya kombinasyon halinde kullanılabilir.

Veri işleme

Kromatografik piklerde malzeme miktarının belirlenmesi için iki yöntem vardır:

(1) Pik yüksekliğini (bu yaklaşık olarak pik alanıyla orantılıdır) veya pik alanını (özellikle stabil olmayan bir taban çizgisinin yaşanabileceği gradyan çalışması için) ölçmek için kayıt cihazı izinin doğrudan kullanımı. İlk yöntem basit ve hızlıdır, ancak açık bir şekilde asimetrik zirveler nedeniyle yerleşik yanlışlıklar vardır.
(2) Elektronik entegrasyon. Açıktır ki bu yöntem daha pahalıdır, ancak çok daha uygun ve daha doğrudur. Maalesef detektör yanıt faktörleri farklı bileşikler için değişiklik gösterir ve bu dikkate alınmalıdır. Türevlendirme, yanıt faktörlerini eşitlemenin iyi bir yoludur.

HPLC Uygulamaları

Nükleositler ve Nükleotidler

Sıvı kromatografi, nükleositlerin ayrılmasında en eski uygulamalarından birini buldu ve kısmen nükleik asit biyokimyasının anlaşılmasındaki hızlı gelişmeden sorumluydu. Daha sonra kromatografi, nükleik asit bileşiminin tanımlanmasında, nükleik asit metabolizmasının aydınlatılmasında ve ayrıca nükleotid havuzlarının miktarının belirlenmesinde geniş bir uygulama da bulmuştur.

Nükleik asit bileşenlerinin kolon sıvı kromatografik ayrılmasına ilişkin en eski rapor Cohn (1949) ‘da bulunabilir. O zamandan beri, sıvı kromatografi bu bileşenlerin ayrılması için en yaygın kullanılan yöntem de olmuştur.

Bazları, nükleositleri ve nükleotitleri ayırmanın standart yöntemi, basit polistiren tipi iyon değişim reçineleri üzerinde de iyon değişim kromatografıydı.

1967’de Horvath, hem stabil hem de nispeten verimli olan ve daha yüksek basınçların uygulanmasını sağlayan, böylece sitidin, üridin, adenozin, timidin mono-, di- ve trifosfatlarının hızlı bir şekilde ayrılmasını kolaylaştıran pelliküler iyon değişim sabit fazlar geliştirdi.

Gözenekli silikaya dayalı sabit fazların müteakip gelişimi, nükleotidleri ve bunların türevlerini hızla ayırabilen çeşitli kromatografik modlara yol açmıştır.

The post Nükleositler ve Nükleotidler – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).