Floresan ölçümleri, absorbans ve ışık saçılım ölçümlerinden daha hassastır. Çözeltideki bir kromoforun absorbans büyüklüğü, konsantrasyonu ve küvetin yol uzunluğu ile belirlenir.

Bir floroforun floresan yoğunluğunun büyüklüğü, konsantrasyonu, yol uzunluğu ve ışık kaynağının yoğunluğu ile belirlenir. Seyreltik çözeltiler için floresan yoğunluğu, florofor konsantrasyonu ile doğru orantılıdır.

Daha yoğun ışık kaynakları, dijital sinyal filtreleme teknikleri ve hassas emisyon fotometrelerinin kullanılmasıyla, floresan ölçümlerinin hassasiyeti, absorbans ölçümlerinin hassasiyetinden 100-1000 kat daha fazla olabilir.

Floresan uygulamaları

Floresan ölçüm tekniklerini kullanan testler, klinik laboratuvarda porfirinleri, ilaçları, hormonları, spesifik proteinleri ve antikorları belirlemek ve hücre fenotiplemesi için rutin olarak kullanılır.

Kullanılan yöntemler, yayılan ışığın doğrudan ölçülmesini ve floresan polarizasyonu, zamanla çözülen floresan, lazerle indüklenen floresan/akış sitometrisi ve seroloji laboratuvarlarında floresan mikroskopisi gibi teknikleri kullanan çeşitli immünoanalizleri içerir.

Florimetreler

Şekil 41.4, basit bir florimetredeki optik düzenlemeyi göstermektedir. Uygun uyarma dalga boyu kaynaktan süzülür ve küvette tutulan çözeltiye yönlendirilir. Ortaya çıkan flüoresan ışığı her yöne yayılır, ancak ortaya çıkan ışığın, emilmeyen kısmı küvetten geçen ve bir ışık tuzağına giren gelen ışına dik açılarda izlenmesi olağandır.

Emisyon dalga boyu, yayılan veya ikincil ışıktan seçilir ve ışın, genellikle bir fotoçoğaltıcı olan dedektöre yönlendirilir. Bunun çıktısı gerektiği gibi güçlendirilir ve işlenir. Amplifikatör kazancı ve uyarı kaynağı sabitse, flüoresan çıktı okuması konsantrasyonla doğrusal olarak ilişkilidir. Bir spektroflorimetre, dalga boyu seçimi için filtreler yerine monokromatörler kullanır.

Birinci nesil florimetreler genellikle cıva buharlı lambalar kullandı. Bu lambaların çıkışları, uyarma dalga boyu seçimini sınırlayan, nispeten az sayıda kesin olarak tanımlanmış bantlarda yoğunlaşmıştır.

Neredeyse sürekli bir spektruma sahip yüksek yoğunluklu bir kaynak, ksenon arkıdır. Ancak bu kaynak ozon üretir ve çok sıcak çalışır. Özellikle klinik pazarı hedefleyen çoğu florimetre, ya bir tungsten halojen ampul ya da daha fazla hassasiyet için hızlı ateşleyen bir ksenon flaş tüpü kullanır.

Kemiluminesans veya benzeri
Kemiluminesans nedir
Kemilüminesans yöntemi
Kemiluminesans ELISA
Kemilüminesans
Kemilüminesans prensibi
Elektrokemilüminesans
Elektrokemilüminesans nedir

Çift ışınlı spektroflorimetreler

Bu aletlerde, kaynaktan gelen ışık demeti kesilir ve numune küveti ile referans küvet arasında bölünür. Her küvet tarafından üretilen floresan, kıyıcı ile elektriksel olarak fazlandırılmış tek bir fotoçoğaltıcı tüp tarafından izlenir. Fark sinyali, referans küvette üretilen flüoresansın çıkarılmasına izin verir ve ayrıca lamba sapmasını ve titremeyi telafi eder.

Floresan polarizasyon analizörleri

Bu aletler, temel olarak, bir dizi uyarma ve emisyon ışığı polarizörünün takıldığı filtre florimetreleridir. Floresan yoğunluğu, uyarma ışınının düzlemine hem paralel hem de dik olarak ölçülür. Floresan depolarizasyon derecesi, moleküler boyutla ilgili olan moleküler rotasyona bağlıdır.

Bu teknik homojen (ayrışmayan) immünolojik testlere uygulanmıştır. Bu uygulamalarda, tipik olarak, bir antijen ve bir flüoresan etiketli antijenin bir antikor üzerindeki bağlanma bölgeleri için rekabet ettiği rekabetçi bir bağlanma immünoanalizi yapılır.

Floresan etiketin yavaş dönen büyük antikora bağlanması, floresan ışığının yüksek oranda polarize kalmasına neden olacaktır. Tersine, bağlanmamış floresan etiketli antijen daha hızlı dönmekte serbesttir ve depolarize floresan üretecektir.

Bu tipteki bazı klinik florimetreler, yalnızca bir floresan türünün ölçümüne adanmıştır. Örneğin, Abbott TDx1 analizör sistemi, yalnızca floresan etiketli immünolojik test reaktiflerini kullanır.

Floresein görünür bölgede emdiği için, bir tungsten halojen ışık kaynağı kullanılabilir. Diğer florimetrik tekniklerle karşılaştırıldığında, duyarlılık düşüktür ve yalnızca küçük moleküllerin tahliline uygulanabilir. TDx1 polarizasyon analizörünün çalıştırılması nispeten basittir ve terapötik ilaç izleme için yaygın olarak kullanılır.

Zaman çözümlü florimetreler

Floresan bazlı immünolojik testler (özellikle homojen testler) ile sıklıkla karşılaşılan bir problem, kan numunelerindeki bazı bileşenlerin (örneğin serum proteinleri, bilirubin ve NADH) neden olduğu yüksek arkaplan floresansıdır.

Uzun floresan bozunma süreleri (> 500 ns) olan zamanla çözümlenmiş ölçümlerin ve etiketlerin kullanılması bu sınırlamayı iyileştirmiştir. Bu tekniği kullanarak, analitten gelen floresans, yalnızca arka plan floresansı bozulduktan sonra izlenir. Yüksek düzeyde floresan lantanit şelatları kullanan otomatik sistemler, çok çeşitli immünolojik testler için ticari olarak mevcuttur.

Perkin-Elmer AutoDELFIA1 sisteminde ölçüm, öropyum şelatları için 1000 ışık/saniye darbesi sağlayan zaman çözümlü bir florimetre ile yapılır. Dedektör, her alıntı darbesinden sonra 400 mikrosaniye (ms) açılır ve yayılan ışığı 613 nm’de 400 ms boyunca toplar. 10 14 mol/l lantanit şelatlarına kadar düşük tespit limitleri mümkündür.

Kemilüminesans

Kemilüminesans, floresandan farklıdır, çünkü uyarma olayı fotolüminasyondan değil, kimyasal veya elektrokimyasal reaksiyondan kaynaklanır. Işık emisyonunun fiziksel olayı, uyarılmış bir singlet durumundan meydana gelmesi ve elektron temel duruma geri döndüğünde ışığın yayılması bakımından floresansa benzer.

Kemilüminesans genellikle luminol, akridinyum esterleri veya lusiferin gibi bir organik bileşiğin bir oksidan (örneğin hidrojen peroksit, hipoklorit veya oksijen) tarafından oksidasyonunu içerir; oksidasyon reaksiyonunda oluşan uyarılmış üründen ışık yayılır.

Bu reaksiyonlar genellikle enzimler (örn. alkalin fosfataz, yaban turpu peroksidaz), metal iyonları veya metal kompleksleri gibi katalizörlerin varlığında gerçekleştirilir.

Luminometreler

Kemilüminesans immünolojik testleri, kimyasal reaksiyon sırasında ışık yayan ışıldayan bileşiklerin kullanımına bağlı olduğundan, gelen bir ışık kaynağına gerek yoktur. Tek sinyal, ışıldayan moleküllerden kaynaklanır ve sonuç olarak, yüksek sinyal-gürültü oranı nedeniyle, bu testler potansiyel olarak çok hassastır.

Prensipte, bir reaksiyon küveti ve ışık geçirmez bir bölme içinde bulunan hassas bir ışık ölçüm cihazından oluşan enstrümantasyon nispeten basittir.

Kemilüminesans uygulaması

Kemilüminesans deneylerinden gelen ışık emisyonunun doğası, tam olarak zamanlanmış reaktif ilaveleri ve çok tekrarlanabilir karıştırma prosedürleri gerektirir. Bu nedenle, uygulamaları, en azından rutin laboratuvarda, özel otomatik immünoassay analizörlerinde kullanımla sınırlıdır.

İmmünoanalizde etiket olarak kullanımları artık küresel teşhis pazarının bu önemli sektörüne hakimdir. Ticari olarak temin edilebilen spesifik kemilüminesans tekniklerinin örnekleri aşağıda verilmiştir. Kemilüminesans immünolojik testleri hormonları, spesifik proteinleri ve belirli ilaçları ölçmek için yaygın olarak kullanılmaktadır.

The post Kemilüminesans – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

4-hidroksi-3-met-ilfeniletilenglikol, 4-hidroksi-3-metoksifenilasetik asit ve 5-hidroksiindol-3-asetik asit dahil olmak üzere biyojenik aminlerin diğer birkaç metabolitinin tespiti de +0,80 V elektrot potansiyeli kullanılarak tespit edilir. Ag-AgC1 referans elektrodudur.

Geleneksel amperometrik elektrokimyasal detektörler kullanılarak biyojenik aminler için minimum tespit limitinin genellikle 10-100 pg aralığında olduğu kabul edilir. Elektrokimyasal tespitte nispeten yeni bir gelişme, farklı potansiyellerde çalıştırılan iki çalışma elektrotu (anot ve katot) kullanan ikili elektrokimyasal detektörlerin kullanılmasıdır.

Daha yakın zamanlarda, katekolaminleri zenginleştirmek için bir ön kolon ile birlikte mikro-delikli HPLC’de kullanılmak üzere tasarlanmış bir ikili elektrokimyasal detektörün noradrenalin ve adrenalin için minimum tespit limitlerini yaklaşık 3 pg’ye düşürdüğü bildirilmiştir.

Bununla birlikte, daha önce açıklanan çok hassas algılama sınırlarının yalnızca optimum dedektör koşulları altında elde edilebileceği unutulmamalıdır. Mobil fazın iyonik kuvvetinin, detektör yanıtında önemli bir parametre olduğu ve sulu bir ortamda 0.07 M’lik bir tuz konsantrasyonunda optimal olduğu gözlenmiştir.

Mobil fazdaki metanol konsantrasyonu, tespit hassasiyetini de etkileyebilir ve 0.04 M’nin altındaki tuz konsantrasyonlarında metanol varlığının detektör hassasiyetini önemli ölçüde azalttığı bildirilmiştir.

Katekolaminlerin florimetrik tespiti üç ana sınıfa ayrılır, bunlar doğal florimetri, kolon öncesi türevlendirme ve kolon sonrası türevlendirme. Doğal floresan, doğal biyojenik amin moleküllerine özgü floresans özelliklerini kullanır.

Katekolaminler, 310-330 nm’de maksimum emisyon ile 200-220 nm ve 280-300 nm’de eksitasyon maksimumuna sahipken, indoller 210-220 nm ve 270-280 nm’de eksitasyon maksimumuna ve yaklaşık 360 nm’de bir emisyon maksimumuna sahiptir.

Kemilüminesans yöntemi
Kemilüminesans yöntemi pdf
Spektrofotometre absorbans değerleri
Moleküler floresans spektroskopisi
Floresans Nedir
Lüminesans Nedir
Floresans spektroskopisi pdf
Floresans spektroskopisi çalışma prensibi

Doğal floresans kullanan katekolaminler için minimum tespit limitlerinin genellikle 100-300 pg aralığında olduğu ve serotonin için (20 pg) daha düşük olduğu kabul edilir. Bununla birlikte, diğer çalışanlar, bir dizi dopamin metabolitleri için yaklaşık 20 pg’lik tespit limitleri talep ettiler.

Kolon öncesi türevlendirmede, biyojenik amin başlangıçta bir türevlendirme ajanı ile birleştirilerek, gelişmiş flüoresansa sahip bir eklenti üretilir. Katkı daha sonra özümlenir ve kromatografiye tabi tutulur.

En yaygın olarak kullanılan türevlendirme reaktifi o-ftalaldehittir (OPA), ancak dansil klorür ve floreskamin de kullanılmıştır. OPA türevlerinin önemli bir avantajı, 2-8 ° C’de etil asetat içinde saklandığında 100 saatten fazla olduğu gösterilen bilinen stabilitesidir.

Kanda, beyin dokusunda ve idrarda bulunan biyojenik aminlerin OPA türevlerinin iyi kromatografik ayrımları bildirilmiştir. OPA türetmesi kullanılarak plazma ve dokudan biyojenik aminler için minimum saptama sınırlarının 50-100 pg aralığında olduğu kabul edilir.

Daha yakın zamanlarda, sürekli dalgalı bir argon lazeri, gelişmiş algılama hassasiyeti sağlamak için bir uyarım kaynağı olarak kullanılmıştır ve noradrenalin ve dopamin için sırasıyla 5 pg ve 16 pg limitleri talep edilmiştir.

Biyojenik aminlerin saptanması için kolon sonrası türevlendirme teknikleri, florimetrik saptamadan önce bir flüoresan eklentisi oluşturmak için biyojenik aminlerin ilk kromatografik ayrılmasına ve ardından on-line türevlendirmeye dayanır.

En sık kullanılan türetme yöntemleri arasında trihidroksiindol (THI) yöntemi ve o-ftalaldehit (OPA) yöntemi yer alır, ancak son zamanlarda etilendiamin glisilglisin ve 2-siyanoasetamid de kullanılmıştır.

Katekolaminlerin HPLC analizi için THI yöntemi orijinal olarak Mori (1974) tarafından geliştirilmiştir ve son metodolojik gelişmelerle dokularda ve idrarda 20-30 pg noradrenalin minimum saptama limiti bildirilmiştir.

THI yönteminin, doku örneklerinde katekolaminlerin saptanması için OPA yönteminden daha seçici olduğu bildirilmiştir, bu da endojen materyalin ko-kromatografi ile daha az reaksiyon olduğunu düşündürmekle birlikte, OPA yönteminin tercih edildiğine dikkat edilmelidir. 

Algılama hassasiyetinin sınırlayıcı bir faktör olduğu uygulamalarda genellikle kullanılmasa da, 280 nm dalga boyunda UV saptaması kullanılabilir. Noradrenalin, DOPA ve dopaminin belirlenmesi için minimum saptama limitlerinin 5 ile 10 ng arasında olduğu belirtilmiştir, yani doğal floresans sistemleri kullanılarak elde edilebilenin yaklaşık yarısına eşittir.

İncelenen tespit tekniklerinden elektrokimyasal ve doğal floresan, maliyet, bakım kolaylığı ve numune hazırlama süresi açısından genel olarak karşılaştırılabilir. Türetme gerektiren floresans metodologları, bireysel sistemlerle ilişkili spesifik problemlerle oldukça karmaşıktır.

Örneğin, kolon öncesi türevlendirme ile bir ilk kimyasal reaksiyon gerçekleştirilmeli ve daha sonra türev, kromatografik analiz için reaksiyon karışımından ekstrakte edilmelidir.

Sütun sonrası türetmede, kromatografik sistemin kolon ve detektör arasındaki ölü boşluğu en aza indirmek için dikkatlice düzenlenmesi gerekir; türetme reaksiyonunun tamamlanması için yeterli süreye de izin verilmesi gerekir.

Tespit hassasiyeti açısından, elektrokimyasal dedektörlerin noradrenalin, DOPA ve dopaminin tespiti için doğal floresan kullanan sistemlerden yaklaşık dört kat daha hassas olduğu önerilmektedir.

Bununla birlikte, bazı bileşikler için doğal flüoresans, elektrokimyasal saptamadan eşit veya daha fazla hassasiyet sağlar. Örneğin, elektrokimyasal saptama homovanillik asidin ölçümü için floresandan daha duyarlı iken, Shy-droxyindoleacetic asit için eşit derecede duyarlıdır ve triptofan ölçümü için daha az duyarlıdır.

Belirli bileşiklerin ölçümü için hem kromatografik sistemin hem de kullanılan detektörün dikkatlice değerlendirilmesi gerektiği bilinmelidir. Örneğin, elektrokimyasal detektörler genellikle numune enjeksiyonundan sonra büyük bir solvent cephesi gösterir.

Bu sorun, elektrokimyasal detektörlerin çözücü sisteminin bileşimindeki değişikliklere olan duyarlılığından kaynaklanmaktadır ve pratik olarak bu, kısa tutma sürelerine sahip bileşiklerin çözücü cephesine gömülebileceği anlamına gelir.

Sonuç olarak, katekolaminlerin kantitasyonu için seçilen spesifik detektör, sistemin kullanılacağı spesifik uygulamaya çok bağlıdır.

Yüksek hassasiyet gerektiren sistemler için elektrokimyasal veya floresans türevlendirme sistemleri muhtemelen optimaldir. Duyarlılık bir sorun değilse, o zaman açıkça dedektör seçimi daha geniştir ve seçilen sistem elektrokimyasal, doğal floresan ve hatta UV saptamasını kullanabilir.

Vitaminler

Vitaminler, suda çözünebilen veya yağda çözünebilen olarak iki gruba ayrılmaktadır. Geleneksel saflaştırma yöntemleri, çok düşük vitamin içeriği nedeniyle büyük miktarlarda dokunun ilk ekstraksiyonunu gerektirdi ve bu nedenle aşağıdaki kriterleri karşılayan alternatif bir yaklaşım gerekliydi:

(1) Eser miktarları önemli bir kayba neden olmadan işleme yeteneği.
(2) Hız.
(3) Isı, UV ışığı ve oksidasyon kaynaklarından kaçınabilir.
(4) Pek çok vitamin yararlı kromoforlar içermediğinden, oldukça hassas bir tespit sistemine uygun şekilde birleştirilmiştir.

The post Florimetrik Tespit – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).