TaqMan prosedürü hem son nokta ölçümü hem de gerçek zamanlı olarak PCR amplifikasyonunun tespiti için geçerlidir. Floresandaki artış, bir tungsten halojen lamba ve CCD kamera sistemi kullanan Applied Biosystems 7900 ve 7000 termal döngüleyiciler gibi bir lüminesans spektrofotometresi veya floresandaki artışları tespit etmek için bir lazer tarama formatı kullanan 7700 kullanılarak tespit edilebilir. termocycle protokolünde tanımlanmış zaman noktaları. Bu DNA dizi dedektörleri, birkaç değişiklikle SYBR yeşili, akrep probları ve moleküler işaret teknolojileri için de kullanılabilir.

TaqMan uç nokta algılama

Son nokta tespiti, TaqMan PCR tamamlandıktan ve veriler toplandıktan sonra gerçekleştirilir (yani döngü 35, 40, vb.). Son nokta tespiti için, flüoresanstaki artış, “şablonsuz kontrolün” flüoresansı ile karşılaştırılır ve enterferans yapan flüoresans dalgalanmaları normalleştirilir.

Bu, her reaksiyon için RQ (raportör:söndürücü) olarak bilinen bir oranı tanımlamak için raportör boyanın emisyon yoğunluğunun söndürücü boyanın emisyon yoğunluğuna bölünmesiyle elde edilir. Örnek RQ (RQþ) ve şablonsuz kontrol RQ (RQ ) arasındaki fark, RQ olarak tanımlanır ve PCR sırasında üretilen sinyalin büyüklüğünü güvenilir bir şekilde gösterir.

TaqMan gerçek zamanlı algılama

Gerçek zamanlı TaqMan PCR sırasında, PCR’nin her döngüsü sırasında ölçülen floresan değeri, o döngüde amplifiye edilen ürün miktarını temsil eder. ABI 7700 dizi algılama sistemi, termal döngüleyicinin 96 kuyunun her birinde birkaç saniyede bir 500-600 nm’de floresan emisyonu toplar.

Fiber optik kablolar aracılığıyla yönlendirilen bir lazer, tüpteki floresan boyaları uyarır. Bu kablolar daha sonra floresan emisyonlarını kendi dalga boylarına göre algılandıkları bir CCD kameraya geri taşır.

Daha sonra Rn olarak adlandırılan bir değer, PCR’den önce raportör sinyalinin normalleştirilmiş raportör sinyalinden çıkarılmasıyla her numune için hesaplanır. Yazılım ayrıca, PCR ürününde istatistiksel olarak anlamlı bir artışın ilk tespit edildiği döngü olan bir eşik döngüsü (Ct) hesaplar. Ct, tüm gerçek zamanlı nicel analizlerin temelidir.

Digital PCR Nedir
Kalitatif analiz ne demek
Kalitatif analiz nasıl yapılır
Kalitatif analiz yöntemleri
Nicel analiz nedir
Nicel analiz yöntemleri
Nicel analiz Nedir Kimya
Kalitatif ve kantitatif örnekleri

Mutlak Miktar Tayini

TaqMan PCR mutlak miktar tayini, bilinen konsantrasyon standartları ve hedef amplikona benzer bileşim kullanılarak gerçekleştirilir. Plazmit DNA ve in vitro transkribe edilmiş RNA, TaqMan testleri için mutlak standartlar olarak yaygın olarak kullanılır.

mRNA ekspresyon seviyelerinin ölçümü için bir DNA standardı optimal seçim değildir; cRNA (kopya RNA) veya bilinen konsantrasyondaki RNA, ters transkripsiyon reaksiyonunun verimliliğini hesaba kattığı için tercih edilir. Kopya RNA standartları, bir dizi dış primer kullanılarak TaqMan1 PCR amplikonundan biraz daha büyük bir dizi amplifiye edilerek oluşturulabilir.

Amplikon daha sonra uygun bir vektöre klonlanabilir ve cRNA’ya kopyalanabilir. TaqMan PCR testinde standardın seri dilüsyonlarının amplifiye edilmesiyle standart eğriler oluşturulur. Test numuneleri daha sonra numunedeki hedef miktarını belirlemek için standart eğri boyunca çizilir.

Bağıl niceleme

Göreceli niceleme, farklı numuneler arasındaki hedef dizilerdeki farklılıkları nicel olarak değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Göreceli bir nicel TaqMan deneyinin amacı, bir hedef mRNA veya DNA molekülünün farklı bir hedef moleküle veya farklı koşullar altında kendisine oranını belirlemektir.

Sonuç daha sonra bir kalibratör numunesine göre kat farkı olarak rapor edilebilir. Hedef gen ekspresyonunun nispi niceliğini hesaplamak için iki yöntem vardır: standart eğri yöntemi ve karşılaştırmalı Ct yöntemi.

Standart eğri yöntemi

Standart eğri yöntemi için, hem hedef hem de endojen kontrol testleri için standart eğriler oluşturulur. Her test numunesi için hedef miktarı ve kontrol miktarı uygun standart eğriden belirlenir. Ardından hedef miktar, normalleştirilmiş bir hedef değer elde etmek için endojen kontrol miktarına bölünür. Göreceli ifade seviyelerini hesaplamak için normalleştirilmiş hedef değerler, kalibratör ile normalleştirilmiş hedef değerlere bölünür.

Karşılaştırmalı Ct yöntemi

Karşılaştırmalı Ct yöntemi için, bağıl niceleme değerleri, PCR sırasında oluşturulan eşik döngüsü (Ct) değerlerinden hesaplanır. Ct değeri, PCR ürününde istatistiksel olarak anlamlı bir artışın ilk tespit edildiği döngüdür. Göreceli niceleme için karşılaştırmalı Ct yöntemi, aşağıdaki denklemi kullanarak bağıl gen ifadesini hesaplar:

• Bağıl miktar 1⁄4 2 Ct

Ct, hedef numunenin Ct’si endojen kontrolün Ct’si ile normalize edilerek hesaplanır (Ct hedef Ct endojen kontrol). Daha sonra Ct, hedef numune için karşılık gelen ortalama Ct’den kalibratör numunesi için ortalama Ct çıkarılarak hesaplanır. Hedef gen ekspresyonunun nispi seviyeleri daha sonra kalibratör numunesine göre kat değişimi olarak ifade edilir.

Karşılaştırmalı Ct yöntemini kullanan nispi niceleme, hem hedef hem de endojen kontrol genleri için benzer PCR amplifikasyon verimliliklerine bağlıdır.

Temizlik genleri

Kantitatif PCR deneysel tasarımının önemli bir yönü, uygun bir referans veya temizlik geninin seçimidir. Endojen kontrol genleri ayrı ayrı veya bilinmeyen hedefle birlikte test edilebilir ve nihai oranları hesaplanabilir.

Hedef ve endojen kontrol geninin eşzamanlı amplifikasyonu, bireysel numunelerdeki toplam nükleik asit konsantrasyonu ve kalitesinin yanlış tahmininden kaynaklanan hataları en aza indirir.

İdeal bir endojen kontrol veya referans gen, farklı doku tipleri ve bireyler arasında sabit bir seviyede eksprese edilmeli ve deneysel tedaviden etkilenmemelidir.

Ek olarak, housekeeping geninin ekspresyonu, bilinmeyen hedefin ekspresyonu ile karşılaştırıldığında çok yüksek olabilir ve böyle bir durumda, iki hedef arasındaki amplifikasyonun etkinliği önemli ölçüde farklılık gösterebilir.

Aynı tüpte birden fazla hedefi yükselten reaksiyonlarda doğru niceleme için, iki reaksiyonun rekabet etmemesi önemlidir. Bu, farklı hedeflerin nispi bolluğuna bağlı olan PCR’de kullanılan primerlerin konsantrasyonunun sınırlandırılmasıyla önlenebilir.

Üç gen, mRNA ekspresyon çalışmaları için endojen kontroller olarak yaygın olarak kullanılır. Bunlar, temizlik genleri -aktin, gliseraldehit 3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH) ve ribozomal RNA (rRNA) için spesifik mRNA’ları içerir. -aktin mRNA, çoğu hücre tipinde bol miktarda eksprese edilir ve her yerde bulunan bir hücre iskeleti proteinini kodlar. Bununla birlikte, psödojenlerin varlığının nicel sonuçlara müdahale edebileceğini not etmek önemlidir.

The post Mutlak Miktar Tayini – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).