Türevlendirme, kromatografiden önce veya sonra gerçekleştirilebilir.

Ön sütun türevlendirme

Ön kolon türevlendirmesinin avantajları, sadece örnek tespitinin geliştirilebilmesi değil, aynı zamanda bileşiklerin ekstraksiyonunun, saflaştırılmasının ve kromatografisinin modifiye edilebilmesidir. Ek olarak, çok çeşitli reaktifler mevcuttur.

Bununla birlikte, kolon öncesi türevlendirmenin dezavantajları, örneklerin türevlendirme prosedürü sırasında bozunması ve kimyasal reaksiyonların tamamlanmayarak kromatogramda sahte zirvelere yol açmasıdır.

Sütun sonrası türevlendirme

Ön kolon türevlendirmeden farklı olarak, kolon sonrası türevlendirme reaksiyonunun tamamlanmasına gerek yoktur, ancak reaksiyonun boyutu tekrarlanabilir olmalıdır. Reaktör tasarımının çok önemli bir faktör olmasına yol açan, bant yayılmasını sınırlandırma arzusuyla birleştiğinde bu gerekliliktir.

Üç reaktör tasarımı popülerdir, spesifik seçim reaksiyon hızına bağlıdır ve ideal olarak çok hızlı olmalıdır (<30 s). İlk tasarım, hem kolon eluent hem de reaktif ile basit bir T-bağlantı noktasıyla sağlanan basit bir bobinden oluşur ve 1 dakikadan daha kısa reaksiyonlar için idealdir.

5 dakikaya kadar küçük cam boncukların (<20 pm) paketlenmiş yataklarının reaksiyonları için kullanılır ve daha uzun reaksiyon süreleri için bant genişlemesini en aza indirmek için hava bölümlü akış sistemi gereklidir.

Tüm bu yöntemlerin numuneyi tahrip ettiği ve bu nedenle pik toplama gerekliyse bir tür eluent akışı bölme işleminin gerekli olduğu bilinmelidir. Sütun sonrası türetme yöntemlerinin bazı örnekleri bulunabilir.

HPLC
HPLC ve GC arasındaki Farklar
Türevlendirme nedir
HPLC dedektörleri
Gaz kromatografisi Dedektörleri
Hplc Nedir
DAD dedektör
HPLC ve GC karşılaştırma

Sütun yapımı

Çoğu HPLC kolonunda kullanılan 316 paslanmaz çelik dahil olmak üzere tüm metaller sonunda kimyasal korozyona uğrar ve özellikle halojenür iyonları HPLC sistemi kullanılmadığında tamamen çıkarılmalıdır. Tüm HPLC bileşenlerinin ya saf çözücüler içinde ya da organik çözücülerin sulu karışımları içinde depolanması iyi bir genel uygulamadır.

Düzensizlikler performans kaybına ve “kolondan kolona” zayıf tekrarlanabilirliğe neden olabileceğinden, tüm HPLC kolonlarının pürüzsüz bir iç yüzeye sahip olması çok önemli bir gerekliliktir.

En popüler kolon boyutları 150 mm X 4.6 mm I.D. tipik analitik uygulamalar için, hazırlayıcı ölçek ayırmaları için çok daha büyük kolon çapları mevcuttur. Daha yakın zamanlarda, analitik uygulamalar için daha küçük çaplı kolonlara büyük ilgi olmuştur, örn. mikro delik (0.5-1.0 rahibe kimliği); paketlenmiş kapiler (80-125 pm I.D.) ve açık tübüler kapiler (30-50 pm I.D.); bunlar Bölüm 10.9’da daha ayrıntılı olarak tartışılmaktadır.

Frits

Bir HPLC mikro partikül kolonunun giriş friti genellikle 2 pm gözeneklidir ve mikropartikülat maddenin toplanması için en sık görülen noktadır, bu da sonunda artan geri basınçlara neden olur.

Fritler nispeten ucuz olduğu için en iyi çözüm eski friti yenisiyle değiştirmektir. Alternatif olarak, fritler ultra sonikasyon veya güçlü asitlerle işlem kullanılarak temizlenebilir.

Çoğu üretici, her bir ucunda aynı fritlere sahip kolonlar tedarik eder ve bu nedenle, genellikle tavsiye edilmemesine rağmen, kolon ters çevirme, üst fritin dışarı atıldığı bir yöntem olabilir. Bu yöntem, kolonun iyi paketlenmiş olması ve orijinal üst uçta hiç boşluk hacmi olmaması koşuluyla iyi çalışır.

HPLC’de mikro sütunlar

HPLC’deki en hızlı ilerleyen alanlardan biri, mikrokolon teknolojisidir ve çok uzak olmayan bir gelecekte yapılacak gelişmeler, muhtemelen mikrokolon HPLC teknolojisinin daha genel kullanıma sunulmasıyla sonuçlanacaktır.

Mikrokolon teknolojisindeki araştırmalar, 1960’ların sonlarında Horvath ve Lipsky (1966) tarafından 1 m uzunluğunda ve sadece 0,5 mm çapında olan ve pellicular materyalden oluşan bir pakete sahip kolonlar kullanılarak başlatıldı. Daha sonraki gelişmeler, bunların yerine 4-5 mm iç çapa ve 15-30 cm uzunluğa sahip kolonların geçmesi ile sonuçlanmıştır.

Mikro sütunların geleneksel sütunlara göre kendine özgü avantajlara sahip olduğu ve bir dizi farklı grup tarafından yapılan son çalışmalar, geniş olarak üç farklı kategoriye ayrılabilen mikro sütunların daha da geliştirilmesine yol açmıştır: mikro delikli (veya küçük delikli) paketlenmiş sütunlar, açık boru şekilli kılcal sütunlar ve paketlenmiş kılcal sütunlar.

Microbore paketlenmiş kolonlar

Bu kolonlar, yaklaşık 1 mm’lik bir iç çapa sahip olmaları dışında normal HPLC kolonlarına benzer. Paketleme malzemeleri, normal bulamaç paketleme teknikleriyle paslanmaz çelik kolonlara paketlenmiş küçük çaplı partiküllerden (3-30 pm) oluşur.

Silika jel sabit faz ile paketlenmiş 1 m’lik kolonlar kullanılarak iç çapın kolon verimliliği üzerindeki etkisinin incelenmesi, en düşük plaka yüksekliği değerlerinin (H) yaklaşık 1.02 mm’lik bir iç çap ile elde edildiğini göstermiştir.

Partikül boyutlarının etkisi de incelendi ve sonuçlar, 20 pm’lik bir paketlemenin optimum azaltılmış plaka yüksekliği eğrisini ürettiğini, ancak hem 5 pm hem de 10 pm paketlemelerin daha yüksek kolon verimleri verdiğini gösterdi. çap ve partikül boyutu, yalnızca ekipmanlarının belirli sabit fazı ve ekstra kolon ölü hacmi için geçerli olabilir.

Mikro delikli kolonların numune kapasitesinin, azaltılmış kesit alanlarından dolayı geleneksel kolonlara kıyasla çok daha düşük olduğu da not edilmelidir.

Açık boru şeklindeki kılcal kolonlar

Açık boru şeklindeki kapiler (OTC) kolonlar, gaz kromatografisinde kullanılan kapiler kolonların analoglarıdır ve genellikle çok düşük iç çaplara (50 pm veya daha az) sahip cam kolonlardan oluşur. sütun duvarına eşit olarak dağılmıştır.

Teorik olarak, OTC kolonlarının performansının geleneksel dolgulu kolonların performansına uyması için, iç çapın 10-30 aralığında olması gerekir.

OTC sütunlarından ayrıştırılan zirveler çok düşük hacimlidir ve bu, geleneksel detektörlerdeki (5-10 ul) akış hücrelerinin hacimleri elüe edilen tepe hacimlerinden çok daha büyük olduğu için teknik zorluklar yaratabilir.

Bu tür dedektörler OTC kolonları ile kullanıldığında bant dağılımı sonuçlanabilir ve bu şekilde bu kolonların içsel avantajlarını geçersiz kılar. Bu nedenle, akış hücresi hacmi 0.01-1 pl aralığında olmalıdır.

Benzer şekilde, kılcal sistemlerde hem minimum ölü hacim hem de enjeksiyon hacminde özel ön konsantrasyon ve numune alma tekniklerinin geliştirilmesini gerektiren bir azalma için bir gereklilik vardır.

OTC kolonlarının diğer bir kısıtlaması, numunenin aşırı yüklenmesine neden olabilecek küçük iç çaplarıdır; sadece 10 ng’den az miktarlar kullanılmalıdır.

The post Türevlendirme – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

Durağan faz başlangıçta protonlanmış form (SH +) olarak dengelenir, proton daha sonra metal iyonu (M) ile yer değiştirir ve ardından bağlantı koordine edilir (SMLt). Elüsyon, asitleştirme veya rakip bir bağ (gösterilmemiştir) ilavesiyle elde edilir, ancak ikincisi metal iyonunu çıkarmaz.

 Sabit Faz Özellikleri

Metal şelat kromatografisi, başlangıçta agaroz ve polistiren divinilbenzen gibi düşük basınçlı sabit fazlar kullanılarak geliştirilmiştir. Silika mikro kürelerin eklenmesi, daha hızlı akış hızlarının kullanılmasına izin vermiş ve verimliliği artırmıştır.

Silikaya bağlı metal iyon komplekslerinin bazı örnekleri Şekil 9.5’te gösterilmektedir. HPLEC’de kullanılan popüler bir kiral ligand, amino asit prolindir. Alternatif olarak, bir iyon değişimli sabit fazda D, L-amino asitleri ayırmak için mobil faza bir prolin-bakır kompleksinin eklenmesi kullanıldı.

Hem küçük kiral moleküller hem de daha büyük biyopolimerler (LKB Enantiopak) içeren HPLEC sabit fazları ticari olarak mevcuttur. İkinci sabit faz kullanılarak ayrılan bileşiklerin bir listesi  gösterilmektedir.

HPLEC sabit fazlarının hazırlanmasında kullanılan yöntemler, yumuşak jel matrisleri için geliştirilenlere benzer: kontrollü gözenekli camı 3- (2-aminoetil-1amino) propil-trimetoksisilan ile işleme tabi tutarak ve ardından kolonu perfüze ederek Bakır sülfatlı kolon, bir bakır şelat desteği hazırlanır.

Silikanın bakır sülfat ile doğrudan işlenmesi de kullanılabilir. Bu durağan fazların hazırlanmasında kullanılan yöntemler literatürde bulunabilir.

yüksek performanslı sıvı kromatografisi (hplc)
HPLC pik yorumlama
HPLC kolon seçimi
HPLC PDF
HPLC çalışma prensibi
HPLC ile yapılan Analizler
Hplc Nedir
HPLC sonuç değerlendirme

Mobil Faz Efektleri

Amino asitler ve dansil amino asitlerin ayrılması için mobil faz kiral katkı maddelerinin kullanımı daha önce gözden geçirilmiştir. Çoğu ayırma, metal olarak bakır (I1) ile N, N-di-n-propil-1-alanin gibi bir ligand kullanılarak ters faz modunda gerçekleştirilmiştir.

Başlangıçta çözülmeyen türler, mobil faz koşullarının değiştirilmesiyle ayrılabilir. Koordinasyon kompleksinin oluşumu dipol etkileşimlerine bağlı olduğundan, pH, iyonik kuvvet, sıcaklık gibi mobil faz parametrelerinin değiştirilmesi ve ayrıca metal iyonunun tipi tutmayı etkileyecektir. HPLEC’de kullanılan en yaygın metal iyonları şunlardır: Zn (II), Cu (II), Ni (II), Co (II), Hg (I1) ve Cd (I1).

Hareketsizleştirilmiş nikel iminodiasetat üzerinde amino asitlerin tutulmasına ilişkin bir çalışmada, hem amino asitlerin hem de metal iyonunun koordine edildiği sabit fazın iyonizasyonu nedeniyle pH değişiminin farklı amino asitler üzerinde farklı bir etkiye sahip olduğu bulunmuştur.

Histidin ve sistein kalıntıları, nötr pH’ta Zn (I1) ve Cu (I1) ile stabil kompleksler oluşturacaktır ve bu nedenle, peptitleri veya proteinleri ayırırken kritik kalıntılardır.

Özet

Hem HPLAC hem de HPLEC, kromatografi alanına yeni girişlerdir ve şu anda ticari olarak temin edilebilen sabit fazların nispeten azı yaygın olarak kullanılmaktadır. HPLEC tarafından yapılan en önemli katkı, optik izomerlerin saflaştırılmasının basitleştirilmesi ve diğer geometrik izomerlerin ayrıştırılmasındaki potansiyel kullanımıdır.

Pratik Yönler

Bu bölümün amacı, başarılı ve tekrarlanabilir ayırmalar için hayati önem taşıyan daha genel hususları kromatografi uzmanına tanıtmak veya hatırlatmaktır. Bunu yaparken, bölüm hem acemilere hem de daha deneyimli kromatograflara fayda sağlayacak bir dizi kromatografik ipucu ve püf noktası içerir. Kromatografik sistem bir bütün olarak tartışılacak ve daha sonra tek tek bileşenler incelenecektir.

Genel Operasyon

Başlangıçta solvent rezervuarları, önerilen kromatografik ayırma için yeterli mobil faz içerdiklerinden emin olmak ve böylece pompalara hava çekilmesini önlemek için kontrol edilmelidir. Mobil faz daha sonra dedektörden sabit bir taban çizgisi sinyali elde edilene kadar kolon boyunca pompalanabilir.

Bu genellikle 4,6 mm I.D için 0,5 ile 4 ml / dakika arasında bir akış hızı gerektirir. 5 ila 60 dakika arasındaki herhangi bir şey için sütun. Geri döndürülemez hasara neden olabileceğinden, sütun geri basıncının sütun için önerilen sınırlamaları aşmamasına dikkat edilmelidir.

Daha sonra, sistemin düzgün çalıştığından ve belirli uygulama için yeterli seçicilik, çözünürlük ve tutmanın elde edildiğinden emin olmak için bir test numunesi enjekte edilmelidir. Kolona yüklenen bileşenlerin her birinin daha sonra kolondan ayrıştırılmasının sağlanması önemlidir.

Bu, ya numune bileşimi bilgisi ile ya da güçlü bir şekilde bağlanmış herhangi bir malzemeyi uzaklaştırmak için çok daha güçlü bir mobil faz ile sütunun yıkanması ile elde edilir. Mobil fazın kolonla uyumlu olmasını sağlamak için her zaman özen gösterilmelidir.

Bileşenlerin kolon üzerinde kalması durumunda, bunlar daha sonra yavaşça sızarak takip eden kromatografik çalışmada anormal zirvelere veya aşırı temel gürültüye neden olabilir. Ek olarak, kirlilikler kolon üzerinde birikerek kolon verimliliğinde bir azalmaya neden olabilir. Kromatografi, tatmin edici kromatogramlar elde edilene kadar alternatif mobil fazlarla tekrar edilebilir.

Bir HPLC Ayrımının Oluşturulması

Başarılı bir HPLC analizinin kurulduğu yöntem, büyük ölçüde numune bileşimi hakkında bilinenler tarafından belirlenir. Örneğin, belirli bir tipteki bilinen bileşikler için okuyucunun, daha önce hangi sistemlerin açıklandığını belirlemek için bu kitapta yer alan uygulama bölümlerine başvurması tavsiye edilir. Alternatif olarak, bilinmeyen bir bileşik veya kitabında açıklanmayan bir bileşik için, okuyucu bu bölümde ve Bölüm 2’de ana hatları verilen ilk ilkelere dayalı olarak bir ayrım oluşturabilecektir.

Mod Seçimi

Belirli bir örnek için, en uygun durağan fazın seçimine izin vermek için çok az bilgi gereklidir. Mod seçim tablosu kullanılarak seçim kolaylıkla yapılabilir. Herhangi bir özel uygulamaya uygun modun kısmen numunenin moleküler ağırlığına ve kısmen de fiziko-kimyasal karakterine bağlı olduğu görülebilir. Esasen, aşağıda kısaca özetlenen dört ana ayrım kategorisi vardır.

The post HPLC Ayrımı – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

NPC’de sıcaklığın etkisine ilişkin erken gözlemler, genel bir kural olarak, sıcaklıktaki bir artışın tutmada bir azalmaya yol açtığını gösterdi; ancak bu genelleme, çözücüdeki spesifik polar değiştiriciye bağlıdır; örneğin etanol, tutulmada bir artışa neden oldu.

Daha yeni çalışmalar, sıcaklık etkilerinin durağan fazın doğasına bağlı olduğunu ve incelenen en polar fazın, sıcaklık artışıyla birlikte tutmada en büyük azalmayı sağladığını göstermiştir.

Sıcaklığın alıkonma üzerindeki değişken etkisinin alternatif bir açıklaması, durağan faza adsorbe edilen nispi su miktarlarına atfedilmiştir, bu da durağan fazın polaritesiyle ilgilidir. Bu etkilerin bir özeti gösterilmektedir. Bununla birlikte, genel olarak, 40 ° C’nin üzerindeki sıcaklıklar, tutmada bir artışa neden olurken, bunun altında, tutmada bir azalma vardır.

Diğer Hususlar

Normal faz sabit fazlar genellikle ters faz sabit fazlardan daha az kararlıdır. Yaygın bir bulgu, çözünen maddenin karbonil grupları ile Schiff bazlarının oluşumu yoluyla amino kolonlarının bozulmasıdır, ancak bir yeniden etkinleştirme yöntemi önerilmiştir.

NPC’nin temel avantajı, suda sadece az çözünür olan türleri ve ayrıca çok hidrofilik olan ve ters faz desteğinde tutulmayan türleri ayırma yeteneğidir.

Dahası, NPC desteklerinin mevcudiyeti, numunenin hidrofilikliğinin bir başka seçicilik özelliği olarak kullanılmasına izin verir. NPC, RPC kadar popüler olmasa da, şimdiye kadar yüksek organik çözücü konsantrasyonlarında kararsız olarak kabul edilen birçok biyomolekülün, NPC kullanılarak verimli bir şekilde kromatografiye tabi tutulabileceğinin farkına varılmasıyla birlikte giderek daha fazla kullanılmaktadır.

Dad dedektör nedir
HPLC dedektörleri
Sıvı Kromatografisi Nedir
Rid dedektör nedir
Hplc Nedir
HPLC cihazı
Hplc nasıl kullanılır
Yüksek basınçlı Sıvı Kromatografisi

Yüksek Performanslı Ters fFazlı Kromatografi

Kullanılan tüm kromatografik teknikler arasında ters fazlı HPLC, bu kromatografik modda gerçekleştirilen tüm analitik ayırmaların en az% 60’ı ile en popüler olanıdır. Ters fazlı kromatografi terimi, ilk olarak, sulu elüentler ile parafin yağı ve n-oktan’ın sabit bir fazı üzerinde sıvı-sıvı kromatografisi gerçekleştiren Howard ve Martin (1950) tarafından türetilmiştir.

Böyle bir bölme sisteminde, bir polar sabit faz ve daha az polar bir mobil faz kullanan geleneksel metodoloji, mobil fazın durağan fazdan daha polar olmasıyla tersine çevrildi.

Ters faz kromatografisi, durağan faz ile hareketli faz arasındaki çekici kuvvetlerin baskın olduğu diğer çoğu kromatografi tekniklerinden farklıdır. Ters fazlı kromatografide, durağan faz genellikle inert bir hidrokarbondur ve genellikle çözünen madde ile tek etkileşimler hidrofobiktir ve seçiciliğe solvent etkileri hakimdir.

Tipik olarak, ters fazlı kromatografide kullanılan mobil fazlar, ya tek başına su ya da su artı bir organik modifiye ediciden oluşur, ancak son zamanlarda sulu olmayan mobil fazlarda daha fazla ilgi ifade edilmiştir. Bu farklı mobil fazlar, sırasıyla düz sulu, karışık sulu ve susuz ters faz kromatografisi anlamına gelen PARP, MARP ve NARP kısaltmalarıyla sonuçlanmıştır.

Ters faz kromatografisinin genel modundaki varyasyonlar bol olmakla birlikte, bu alanda hızlı gelişmeler devam ederken, bu bölümün sonraki bölümlerinde genişletilecek olan tekniğin genel bir taslağı verilebilir.

Sabit faz genellikle n-oktadesil ligandlarının kovalent olarak bağlandığı küresel silika partiküllerinden oluşur. Diğer popüler ligandlar, n-oktil ve fenildir. Silika mikropartiküllerinin çapı genellikle analitik uygulamalar için 25 um’den küçüktür, ancak hazırlayıcı HPLC’de bu çap genellikle daha büyüktür.

Sabit faz genellikle 4-5 mm iç çapa ve 50-300 mm uzunluğa sahip paslanmaz çelik analitik kolonlar halinde paketlenir, ancak son zamanlarda daha kısa kolonlar ve daha küçük çaplı paketlere doğru bir eğilim vardır.

En popüler mobil fazlar sulu veya sulu artı metanol veya asetonitril gibi organik bir değiştiricidir. Mobil fazlar genellikle analitik bir kolondan 0.5-2 ml / dk’da pompalanırken, hazırlayıcı kolonlardan akış hızları genellikle çok daha yüksektir.

Ters faz modunun popülaritesi, potansiyel kromatografi için sahip olduğu sayısız avantaj nedeniyle anlaşılabilir bir durumdur. Bu avantajların en büyüğü, hareketli faz bileşiminin çeşitliliği yoluyla geniş bir çözücü etkisinin kullanılmasına izin veren sabit fazın eylemsizliğidir; örneğin, tuzların eklenmesi ve hareketli faz pH ve sıcaklığının değiştirilmesi.

Bu bölümde, yukarıda tartışılan ters fazlı kromatografinin her yönü, potansiyel kromatografi mobil faz ve durağan fazın birçok olası kombinasyonu boyunca yönlendirmeye vurgu yapılarak daha ayrıntılı olarak ele alınacaktır.

Sabit Fazlar

Ters faz kromatografisinde en yaygın kullanılan sabit faz, silikaya kovalent olarak bağlanmış oktadesilsilan gruplarından (ODS) oluşur; bununla birlikte, farklı kromatografik karaktere sahip bir dizi farklı ODS paketi kullanılmaktadır ve bunlar bu bölümde ele alınacaktır. Ek olarak, ODS’nin yanı sıra bir dizi farklı fonksiyonel grup silikaya bağlanabilir ve bunlardan daha popüler olanlarından bazıları da tartışılacaktır.

Oktadesilsilan (ODS) Salmastralar

ODS ambalajları genel olarak monomerik ve polimerik fazlara ayrılabilir. Monomerik fazlar genellikle bağlı ligand tarafından daha homojen bir silika kaplamasına sahiptir ve nispeten daha düşük bir karbon yüküne sahiptir, bu da yüksek oranda serbest silanol gruplarına neden olabilir.

Bu nedenle, tamamen uç başlıklı olmayan monomerik ambalajlar, geleneksel solvofobik etkileşimlere ek olarak bölme etkilerinin ortaya çıkması nedeniyle karışık bir kromatografik ayırma mekanizması sergileyebilir. Monomerik fazlar genellikle polar çözünen maddelerin ayrılması için polimerik ODS fazlarından daha etkilidir.

Polimerik fazlar genellikle nispeten yüksek bir karbon yüklemesine sahiptir, ancak yoğun hidrofobik zincirlerin doğası nedeniyle polar bileşikler için zayıf kütle transfer özellikleri gösterir.

Polimerik fazlar genellikle orta polariteli çözünen maddelerin ayrılması için ve ayrıca polar olmayan bileşikler için tavsiye edilir. Ayrıca, polimerik fazlar daha yüksek bir karbon yüklemesine sahip olduğundan, kolonlar yüksek bir numune yükleme kapasitesine sahiptir ve preparatif kromatografi için daha yararlı da olabilir.

The post Oktadesilsilan (ODS) Salmastralar – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

LABORATUVAR TEKNİKLERİ

HPLC Teorisi

Sıvı kromatografi, bir bileşen karışımının bir kromatografik kolondan geçerek bileşen parçalarına ayrıştırıldığı bir ayırma yöntemidir. Bileşenlerin karışımını içeren hareketli fazın katı partiküllerle dolu bir kolondan oluşan durağan fazdan geçirilmesi ile gerçekleştirilir.

Çözünen maddeler ve iki faz arasında etkiyen fiziksel ve kimyasal kuvvetler, çözünen maddelerin kromatografik sütun üzerinde tutulmasından sorumludur. Bireysel çözünen maddelerin çözünürlüğünü ve dolayısıyla ayrılmasını belirleyen, bu kuvvetlerin büyüklüğündeki farklılıklardır. Alternatif olarak, ayrışmanın, iki faz arasında çözünen maddelerin dağılımı ile belirlendiği düşünülebilir.

Moleküllere etki eden temel kuvvetler beş türdendir:

• (1) London dağılım kuvvetleri veya van der Wads kuvvetleri moleküller arasında işleyerek elektrostatik konfigürasyonlarının anlık bozulmasına neden olur.
• (2) Dipol etkileşimleri geçici olarak bozulan moleküllerde ortaya çıkar ve moleküller arasında elektrostatik çekim ile sonuçlanır.
• (3) Hidrojen bağ etkileşimleri proton vericiler ve proton alıcıları arasında meydana gelir.
• (4) Çözünen moleküller ve yüksek dielektrik sabitli bir çözücü arasındaki elektrostatik çekimden kaynaklanan dielektrik etkileşimler.
• (5) Elektrostatik veya kulombik etkileşimler.

Bu moleküller arası kuvvetleri etkileyen herhangi bir değişken, kromatografik kolondan geçerek elde edilen ayrılma derecesini etkileyecektir.

Tam bir kromatografi teorisi geliştirmek zordur çünkü esasen denge dışı bir süreçtir ve çözücü akışı genellikle hareketli ve sabit fazlar arasında çözünen moleküllerin dengesine izin vermek için çok hızlıdır. Böyle olmasaydı, basit difüzyon, bant yayılmasına ve dolayısıyla zayıf ayrılmaya yol açan önemli bir faktör olurdu.

HPLC sonuç değerlendirme
yüksek performanslı sıvı kromatografisi (hplc)
HPLC pik yorumlama
HPLC çalışma prensibi
HPLC analizleri
HPLC kolon seçimi
HPLC PDF
Hplc Nedir

Ek olarak, bir kolon boyunca çözücü akışının modellenmesi kolay değildir çünkü bu, sabit faz partiküllerinin şekline ve bunların birlikte paketlenme şekline bağlıdır; ayrıca çözücü akımında üretilen sonuçta ortaya çıkan girdaplar teorik problemler ortaya çıkarır. Ulaşmayı umabileceğimiz en iyi şey, tüm kromatografik kolonun ortalamasını tanımlayan bir teoridir.

İyileştirilmiş çözünürlük için, (a) moleküler difüzyonu artırarak veya moleküllerin yayılması gereken mesafeyi azaltarak ve (b) sabit fazın düzgün bir şekilde paketlenmesini sağlayarak akış modelinde iyileştirmeler yaparak daha iyi dengeleme oranları hedeflenmelidir.

Bileşiklerin HPLC ile ayrılması ve saflaştırılması, teorik değerlendirmelerle birbiriyle ilişkilendirilebilen bir dizi fiziksel parametreye dayanır. Başarılı HPLC ayrımlarını gerçekleştirmek için, HPLC’nin pratik kullanımında ortaya çıkabilecek sorunların üstesinden gelmek için bu parametrelerin ve bunların karşılıklı ilişkisinin makul bir şekilde anlaşılması önemlidir.

İlk olarak, verimli ayırmalar yapmak için, “iyi” ve “kötü” sütun arasındaki farkı neyin oluşturduğunun anlaşılması gerekir. Bir bileşenin “iyi” bir sütundan elüsyonu, orijinal numune konsantrasyonundan minimum seyreltmeyi temsil eden keskin, dar bir bant olarak gerçekleşir.

Tersine, “kötü” bir sütun önemli ölçüde seyrelmeye neden olarak geniş bir bandın elüsyonuna ve dolayısıyla farklı bileşenler arasında çok az çözünürlüğe neden olacaktır.

Genel kromatografik sistemin kalitesini belirleyen sadece durağan faz ve bunun kolon içindeki paketlenmesi değildir.

Örneğin, valfler, tüpler ve detektör mobil fazın gereksiz şekilde büyük hacimlerini tutabilir; benzer şekilde, kolon uç parçası tasarımı eşit bir sıvı dağılımı oluşturmayabilir; bu parametrelerden herhangi biri önemli ölçüde bant genişlemesine neden olabilir.

Temel kurallar

Kromatografik teoriyi daha ayrıntılı olarak ele almadan önce, temel parametreleri anlamak önemlidir. Zamana veya hacme karşı çizilen bir kolondan (bir numune detektörünün tepkisi ile belirlendiği üzere) çözünen elüsyon konsantrasyonunu temsil eden tipik bir kromatogramı gösterir.

Numunenin kolona enjekte edilmesinden sonra, durağan faz ile etkileşmeyen bileşikler, zaman zaman boşluk hacmi V, içine taşınacaktır. Boş hacim, durağan fazın parçacıkları ile parçacık gözenekleri içindeki erişilebilir hacim arasındaki ara hacmin toplamını temsil eder.

Numunenin alıkonma süresi (t,) enjeksiyondan ayrıştırılan pikteki maksimum konsantrasyona kadar geçen süredir. Tutma hacmi V, kromatografik bandın merkezinden ölçüldüğü üzere çözünen maddenin ayrıştırılması için gereken çözücü hacmidir. V ve r, aşağıdaki denklemle ilişkilendirilebilir:

K = r, xf

f, akış oranını temsil eder.

Saklama hacmi doğrudan dağıtımla ilgilidir veya sabit ve hareketli fazlar arasında çözünen maddenin (K) bölme katsayısıdır. Burada V, mobil fazın hacmi ve V, sabit fazın hacmidir.

Bir kromatografik kolonun verimliliği, kolonun eşdeğer olduğu teorik plakaların (N) sayısı ile ölçülür.

Terim başlangıçta damıtma sürecini tanımlamak için kullanılmıştır ve ilgili fazlardaki çözünen konsantrasyonların dengede olduğu varsayıldığı bir dizi varsayımsal katman olarak görselleştirilebilir. Teorik plakaların sayısı aynı zamanda bir kolonun neden olduğu bant genişlemesi miktarının bir ölçüsüdür. Formülden hesaplanabilir.

Genel olarak, başlangıçta enjeksiyon hacimlerinin bir Poisson dağılımı verecek şekilde yayılacağı ve ardından bir Gauss dağılımına geçeceği varsayılır. Tipik bir Gauss zirvesi  gösterilmektedir.

Levha numarasının belirlenmesi, bir detektör çizelgesi kaydından basittir, çünkü bükülme noktasında böyle bir eğriye teğetler, taban çizgisini 40 mesafeden keser.

Tepe şekillerinin Gauss olduğunu varsayarsak, tepe genişliği 40 ile verilir. Bu, kromatogramdan ölçülen parametre olabilir ve bu nedenle yukarıdaki formül şu şekilde yazılabilir:

N = 16X (t, / 4) 2

Bununla birlikte, en az hataya neden olan yöntem, tepe genişliğini yarı yükseklikte ölçmektir. Bir Gauss eğrisinin matematiksel özelliklerini kullanarak bu, aşağıdaki formüle yol açar:

N = 5.54 X (t, / yarım yükseklikte genişlik)

N, genellikle sütun performansının bir ölçüsü olarak alıntılanır ve sayı ne kadar büyükse sütun o kadar iyi olur. Genel olarak, küçük partikül çapları, düşük akış hızları, daha yüksek sıcaklıklar, daha az viskoz çözücüler, küçük çözünen moleküller ve iyi kolonlar için N artar.

N’nin değeri, çözünen maddenin tutma süresinden bağımsızdır ancak kolon uzunluğuyla orantılıdır. Farklı kolonlar arasında doğrudan bir karşılaştırma yapılmasını sağlamak için teorik bir plakaya eşdeğer yüksekliğin, H (plaka yüksekliği olarak da adlandırılır) kullanılması daha kullanışlıdır. Aşağıdaki formülle verilir:

H = L / N

burada L, sütunun uzunluğudur. H, bir çözünen maddenin yaydığı miktarı, sahip olduğu mesafeyle karşılaştırır.
ve bunu verimli sütunların H için küçük değerlere sahip olduğu izler. Bir kolonun sonunda bir çözünen maddenin dağıldığı mesafenin ile verildiği gösterilebilir.

The post HPLC Teorisi – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).