LABORATUVAR TEKNİKLERİ

HPLC Teorisi

Sıvı kromatografi, bir bileşen karışımının bir kromatografik kolondan geçerek bileşen parçalarına ayrıştırıldığı bir ayırma yöntemidir. Bileşenlerin karışımını içeren hareketli fazın katı partiküllerle dolu bir kolondan oluşan durağan fazdan geçirilmesi ile gerçekleştirilir.

Çözünen maddeler ve iki faz arasında etkiyen fiziksel ve kimyasal kuvvetler, çözünen maddelerin kromatografik sütun üzerinde tutulmasından sorumludur. Bireysel çözünen maddelerin çözünürlüğünü ve dolayısıyla ayrılmasını belirleyen, bu kuvvetlerin büyüklüğündeki farklılıklardır. Alternatif olarak, ayrışmanın, iki faz arasında çözünen maddelerin dağılımı ile belirlendiği düşünülebilir.

Moleküllere etki eden temel kuvvetler beş türdendir:

• (1) London dağılım kuvvetleri veya van der Wads kuvvetleri moleküller arasında işleyerek elektrostatik konfigürasyonlarının anlık bozulmasına neden olur.
• (2) Dipol etkileşimleri geçici olarak bozulan moleküllerde ortaya çıkar ve moleküller arasında elektrostatik çekim ile sonuçlanır.
• (3) Hidrojen bağ etkileşimleri proton vericiler ve proton alıcıları arasında meydana gelir.
• (4) Çözünen moleküller ve yüksek dielektrik sabitli bir çözücü arasındaki elektrostatik çekimden kaynaklanan dielektrik etkileşimler.
• (5) Elektrostatik veya kulombik etkileşimler.

Bu moleküller arası kuvvetleri etkileyen herhangi bir değişken, kromatografik kolondan geçerek elde edilen ayrılma derecesini etkileyecektir.

Tam bir kromatografi teorisi geliştirmek zordur çünkü esasen denge dışı bir süreçtir ve çözücü akışı genellikle hareketli ve sabit fazlar arasında çözünen moleküllerin dengesine izin vermek için çok hızlıdır. Böyle olmasaydı, basit difüzyon, bant yayılmasına ve dolayısıyla zayıf ayrılmaya yol açan önemli bir faktör olurdu.

HPLC sonuç değerlendirme
yüksek performanslı sıvı kromatografisi (hplc)
HPLC pik yorumlama
HPLC çalışma prensibi
HPLC analizleri
HPLC kolon seçimi
HPLC PDF
Hplc Nedir

Ek olarak, bir kolon boyunca çözücü akışının modellenmesi kolay değildir çünkü bu, sabit faz partiküllerinin şekline ve bunların birlikte paketlenme şekline bağlıdır; ayrıca çözücü akımında üretilen sonuçta ortaya çıkan girdaplar teorik problemler ortaya çıkarır. Ulaşmayı umabileceğimiz en iyi şey, tüm kromatografik kolonun ortalamasını tanımlayan bir teoridir.

İyileştirilmiş çözünürlük için, (a) moleküler difüzyonu artırarak veya moleküllerin yayılması gereken mesafeyi azaltarak ve (b) sabit fazın düzgün bir şekilde paketlenmesini sağlayarak akış modelinde iyileştirmeler yaparak daha iyi dengeleme oranları hedeflenmelidir.

Bileşiklerin HPLC ile ayrılması ve saflaştırılması, teorik değerlendirmelerle birbiriyle ilişkilendirilebilen bir dizi fiziksel parametreye dayanır. Başarılı HPLC ayrımlarını gerçekleştirmek için, HPLC’nin pratik kullanımında ortaya çıkabilecek sorunların üstesinden gelmek için bu parametrelerin ve bunların karşılıklı ilişkisinin makul bir şekilde anlaşılması önemlidir.

İlk olarak, verimli ayırmalar yapmak için, “iyi” ve “kötü” sütun arasındaki farkı neyin oluşturduğunun anlaşılması gerekir. Bir bileşenin “iyi” bir sütundan elüsyonu, orijinal numune konsantrasyonundan minimum seyreltmeyi temsil eden keskin, dar bir bant olarak gerçekleşir.

Tersine, “kötü” bir sütun önemli ölçüde seyrelmeye neden olarak geniş bir bandın elüsyonuna ve dolayısıyla farklı bileşenler arasında çok az çözünürlüğe neden olacaktır.

Genel kromatografik sistemin kalitesini belirleyen sadece durağan faz ve bunun kolon içindeki paketlenmesi değildir.

Örneğin, valfler, tüpler ve detektör mobil fazın gereksiz şekilde büyük hacimlerini tutabilir; benzer şekilde, kolon uç parçası tasarımı eşit bir sıvı dağılımı oluşturmayabilir; bu parametrelerden herhangi biri önemli ölçüde bant genişlemesine neden olabilir.

Temel kurallar

Kromatografik teoriyi daha ayrıntılı olarak ele almadan önce, temel parametreleri anlamak önemlidir. Zamana veya hacme karşı çizilen bir kolondan (bir numune detektörünün tepkisi ile belirlendiği üzere) çözünen elüsyon konsantrasyonunu temsil eden tipik bir kromatogramı gösterir.

Numunenin kolona enjekte edilmesinden sonra, durağan faz ile etkileşmeyen bileşikler, zaman zaman boşluk hacmi V, içine taşınacaktır. Boş hacim, durağan fazın parçacıkları ile parçacık gözenekleri içindeki erişilebilir hacim arasındaki ara hacmin toplamını temsil eder.

Numunenin alıkonma süresi (t,) enjeksiyondan ayrıştırılan pikteki maksimum konsantrasyona kadar geçen süredir. Tutma hacmi V, kromatografik bandın merkezinden ölçüldüğü üzere çözünen maddenin ayrıştırılması için gereken çözücü hacmidir. V ve r, aşağıdaki denklemle ilişkilendirilebilir:

K = r, xf

f, akış oranını temsil eder.

Saklama hacmi doğrudan dağıtımla ilgilidir veya sabit ve hareketli fazlar arasında çözünen maddenin (K) bölme katsayısıdır. Burada V, mobil fazın hacmi ve V, sabit fazın hacmidir.

Bir kromatografik kolonun verimliliği, kolonun eşdeğer olduğu teorik plakaların (N) sayısı ile ölçülür.

Terim başlangıçta damıtma sürecini tanımlamak için kullanılmıştır ve ilgili fazlardaki çözünen konsantrasyonların dengede olduğu varsayıldığı bir dizi varsayımsal katman olarak görselleştirilebilir. Teorik plakaların sayısı aynı zamanda bir kolonun neden olduğu bant genişlemesi miktarının bir ölçüsüdür. Formülden hesaplanabilir.

Genel olarak, başlangıçta enjeksiyon hacimlerinin bir Poisson dağılımı verecek şekilde yayılacağı ve ardından bir Gauss dağılımına geçeceği varsayılır. Tipik bir Gauss zirvesi  gösterilmektedir.

Levha numarasının belirlenmesi, bir detektör çizelgesi kaydından basittir, çünkü bükülme noktasında böyle bir eğriye teğetler, taban çizgisini 40 mesafeden keser.

Tepe şekillerinin Gauss olduğunu varsayarsak, tepe genişliği 40 ile verilir. Bu, kromatogramdan ölçülen parametre olabilir ve bu nedenle yukarıdaki formül şu şekilde yazılabilir:

N = 16X (t, / 4) 2

Bununla birlikte, en az hataya neden olan yöntem, tepe genişliğini yarı yükseklikte ölçmektir. Bir Gauss eğrisinin matematiksel özelliklerini kullanarak bu, aşağıdaki formüle yol açar:

N = 5.54 X (t, / yarım yükseklikte genişlik)

N, genellikle sütun performansının bir ölçüsü olarak alıntılanır ve sayı ne kadar büyükse sütun o kadar iyi olur. Genel olarak, küçük partikül çapları, düşük akış hızları, daha yüksek sıcaklıklar, daha az viskoz çözücüler, küçük çözünen moleküller ve iyi kolonlar için N artar.

N’nin değeri, çözünen maddenin tutma süresinden bağımsızdır ancak kolon uzunluğuyla orantılıdır. Farklı kolonlar arasında doğrudan bir karşılaştırma yapılmasını sağlamak için teorik bir plakaya eşdeğer yüksekliğin, H (plaka yüksekliği olarak da adlandırılır) kullanılması daha kullanışlıdır. Aşağıdaki formülle verilir:

H = L / N

burada L, sütunun uzunluğudur. H, bir çözünen maddenin yaydığı miktarı, sahip olduğu mesafeyle karşılaştırır.
ve bunu verimli sütunların H için küçük değerlere sahip olduğu izler. Bir kolonun sonunda bir çözünen maddenin dağıldığı mesafenin ile verildiği gösterilebilir.

The post HPLC Teorisi – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

Mobil Faz Katkı Maddeleri Olarak IL’ler

IL’lerin HPLC’de öne çıkan başlıca uygulamalarından biri, mobil faz katkı maddeleri olarak kullanımları (düşük konsantrasyon seviyelerinde) ile ilgilidir. İyi bilinen “silanol etkisini” bastırmak amacıyla kullanılır.
Silika, çok yönlülüğü ve kromatografi için uygun özelliklerin geniş listesi nedeniyle muhtemelen RPLC’de kullanılan en yaygın sabit fazdır.

Bununla birlikte, bazı durumlarda, özellikle bazik bileşikler analiz edildiğinde, silika bazlı sabit fazın serbest silanol grupları ile kromatografik ayırma altındaki analitler arasında güçlü etkileşimlerin kurulduğunu belirtmek de önemlidir. Silanol etkisi denen bu etkileşimler zayıf ayırma performansına yol açar: piklerin asimetrisi, yüksek tutma süreleri, düşük verimlilik ve zayıf tekrarlanabilirliktir.

Bu tür silanol etkileşimlerini azaltmak için üç ana olasılık vardır: yüksek su yüzdelerine sahip mobil fazlarla çalışmak (pratik ayırmalar için her zaman mümkün değildir), düşük pH değerleri kullanmak (ki bu da pek uygun değildir) veya mobil faza, silika bazlı sabit fazın serbest silanol grupları için bazik analitlerden daha yüksek afiniteye sahip bir katkı maddesi ekleyin.

Aslında, durağan fazın artık ilanol grupları ile etkileşime girebilen bir katkı maddesinin eklenmesi, ayırmaların çoğunda en yaygın yaklaşımdır. Silanol etkilerinin baskılayıcıları veya maskeleme maddeleri olarak kullanılan geleneksel bileşikler, üçüncül aminlerdir: trietilamin (TEA), sikloheksilamin veya dimetiloktilamindir.

Bu yaklaşım içinde IL’ler ayrıca RPLC’de baskılayıcı maddeler olarak da uygulanmıştır. Kesinlikle, IL’ler mobil faza eklendiğinde, tuzlar olarak hareket ederler (çözelti içinde katyonlar ve anyonlar), ancak bazı durumlarda moleküller arası etkileşimlerinin birçoğunu koruyabilirler. Mobil faza girdikten sonra, IL katyonları ve anyonlar ile sabit fazın yüzeyi arasında birkaç etkileşim kurulur.

İlk olarak, IL’nin katyonları ile analitlerin polar grupları arasında silis yüzeyinin kalıntı silanol grupları için bir rekabet gerçekleşir. Ek olarak, IL anyonları ve bazik katyonik çözünenler arasında iyon eşleşmesi oluşturulabilir.

Hem IL anyonları hem de katyonlar, C18 sabit fazlarında da sorpsiyona maruz kalabilir. Anyonların soğurulmasının Hofmeister serisi PF6􏰰> SCN􏰰> ClO4􏰰 􏰫BF4􏰰> NO3􏰰> I􏰰> Br􏰰> Cl􏰰> F􏰰> H2PO4􏰰> SO4 2􏰰’ye bağlı olduğu gösterilmiştir.

Katyonlarla ilgili olarak, C18 sabit fazlardaki sorpsiyon, IL katyonuna bağlanan alkil zincirinin uzunluğu ile ilgilidir [18]. Ayrıca durağan fazın yüzeyinde zayıf iki tabakalı bir elektronik yapı oluşur. Literatürdeki bir dizi çalışma, IL’ler ve silika arasındaki etkileşim mekanizması ve analit, IL ve silika arasındaki etkileşim hakkında tartışmaktadır.

Her durumda, önemli bir özellik, tüm bu etkileşimlerin temel analitlerin ayrılması üzerinde olumlu etkilere sahip olmasıdır. Bu nedenle, mobil faza bir IL’nin eklenmesi normal olarak bant genişlemesinde bir azalmaya, en iyi çözünürlüklere ve temel analitlerin alıkonma sürelerinde bir azalmaya neden olur.

Ayrıca birçok çalışmanın, IL’leri kullanarak elde edilen sonuçları trietilamin, amonyum asetat veya sodyum dodesil sülfat gibi geleneksel katkı maddeleri ile karşılaştırdığını ve tüm durumlarda önemli bir kromatografik gelişme gösterdiğini ve ayrıca IL’lerin geleneksel maskeleme ajanlarının gerektirdiği miktardır.

HPLC sonuç değerlendirme
HPLC Avantaj ve dezavantajları
HPLC pik yorumlama
HPLC PDF
Gaz kromatografisi
HPLC Makale
HPLC analizleri
HPLC parçaları

Ticari bir ODS HPLC sabit fazı üzerinde altı heterosiklik aromatik aminin ayrılmasının temsili bir örneği Şekil 9.2’de gösterilmektedir. O ve Zhang ve ark. IL’lerin mobil faz katkı maddeleri olarak kullanımını ilk bildiren, özellikle sırasıyla efedrinlerin ve katekolaminlerin ayrılmasını iyileştirmek için katkı maddesi olarak C4MIm-BF4’ü kullanan ilk kişidir. Her iki durumda da, tutma faktörleri, IL’nin sulu faza eklenmesiyle modifiye edildi ve iyi kromatografik ayrımlar sağlandı.

Bu ilk çalışmaların ortaya çıkmasından bu yana, IL’lerin RPLC’de katkı maddesi olarak kullanımına ilişkin büyük bir ilgi arttı, çünkü esas olarak ayırma performansındaki gelişmeler normal olarak gerçekten düşük miktarlarda IL’ler (1 mmol / L1’e kadar) gerektirerek elde edildi. Literatürde şu anda bu önemli konuyu kapsayan çok sayıda inceleme ve kitap bölümü bulunmaktadır.

Tablo 9.1, bazik bileşiklerin kromatografik ayrılmasını iyileştirmek için mobil faz katkı maddeleri olarak IL’lerin uygulamalarının birkaç örneğini içerir. Tüm durumlarda, imidazolyum bazlı IL’lerin tercih edilenler olduğu gözlemlenebilir.

Bunların arasında, muhtemelen C4MIm-BF4, ters fazlı silika bazlı C18 sabit fazlar için uygulamaların çoğunda tercih edilen IL’dir. Bu çalışmalarda düşük IL konsantrasyonlarının gerekli olduğuna dikkat etmek de önemlidir.

Bu yaklaşımla farklı bileşik grupları da analiz edilmiştir. İnorganik bileşiklerin (selenyum türleri) ayrılmasıyla ilgili tek bir uygulama vardır [41]. Bu özel durumda, en iyi sonuçlar, iki IL’yi katkı maddesi olarak karıştırırken elde edildi: C4MIm-Cl ve C4MMIm-BF4. Geri kalan uygulamalarda organik bileşikler, mobil fazda katkı maddeleri olarak IL’lerin varlığında daha iyi ayrılır. Bunlar arasında, temel ilaçlar ve temel organik kirleticiler, incelenen ana analit tiplerini oluşturur.

Bildirilen uygulamalarda, kromatografik ayırmalar normal olarak diyot dizisi tespiti (DAD) veya ultraviyole tespiti (UV) ile birlikte gerçekleştirilir.

Birkaç çalışmada ayrıca floresans saptama (FD), elektrokimyasal saptama (ECD) [29, 35] veya indüktif olarak eşleşmiş plazma-kütle spektrometresi saptama (ICP-MS) kullanılır. Ne yazık ki, ışık saçılımı tespiti (ELSD) veya kütle spektrometrisi (MS) kullanan hiçbir çalışma yoktur, çünkü muhtemelen IL’ler bu dedektörlerle arka girişimlere neden olabilir.

Horváth vd. maskeleme ajanlarının silanol bastırma kabiliyetini değerlendirmek için bir model (􏰫 iki tutma bölgesi modeli) önermişlerdir. Bu model, maskeleme maddeleri olarak imidazolyum bazlı IL’ler dikkate alınarak test edilmiştir.

The post Mobil Faz Katkı Maddeleri Olarak IL’ler – Ayırma Teknolojisi – Katı Sıvı Ayırma Teknolojisi – Kimya Mühendisliği – Ayırma Teknolojisi Ödevleri – Kimya Mühendisliği Ödev Yaptırma – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).