Doku Hazırlama

Enzimlerin incelenmesi için birkaç farklı yöntem mevcuttur, ancak bu bölümde sadece donmuş kesitler, yaymalar ve parafin bölümleri ele alınacaktır. Daha önce belirtildiği gibi, gösterilmesi gereken enzimler esas olarak kullanılan preparat tipine karar verecektir.

Dondurulmuş bölümler

Enzim histokimyasında en yaygın örnek hazırlama, genellikle bir kriyostat ile kesilmiş donmuş kesitlerin kullanılmasıdır. Yavaş dondurma buz kristali eserlerine neden olacağından doku hızlı bir şekilde hızlı dondurulmalıdır: daha hızlı dondurma daha küçük buz kristalleri üretir. Kas biyopsileri, tanısal enzim histokimya örneklerinin çoğunu açıklar, ancak buz kristali artefaktına çok eğilimlidir.

Kası dondurmak için en uygun yöntem, sıvı nitrojen ile dondurulmuş ve kısmen çözülmesine izin verilen izopentan kullanmaktır. Katı fraksiyon, dokunun donması sırasında sıvı fraksiyonun sıcaklığını sabit (150 ° C) tutarak termal bir tampon görevi görür. Doku (sabitlenmiş veya sabitlenmemiş) OCT jeli içinde bir mantar disk üzerinde yönlendirilir ve jel ve numune donana kadar eritme izopentanına daldırılır.

Mantar, OCT bileşiği kullanılarak blok tutucuya benzer şekilde tutturulur ve daha sonra 23 ° C’de bölümlemeye hazır şekilde kriyostat içine yerleştirilir. Tek başına sıvı nitrojen kullanılmamalıdır, çünkü düşük bir termal iletkenlik oranına sahiptir ve doku çevresinde gazlı bir termal bariyer oluşturur ve bu da büyük buz kristallerinin oluşmasına izin vererek hücresel hasara neden olur.

Lekeler

Yaymalar, kan, kemik iliği ve doku hücresi süspansiyonlarından çeşitli yöntemlerle hazırlanabilir. Doku lekeleri, örn. lenf düğümleri, taze dokunun kesildiği ve yeni yüzeyin temiz bir cam slayta nazikçe dokunduğu durumlarda da yararlıdır. Çoğu yayma havayla kurutulur ve hücrelerin sitokimyasal boyanmasından önce genellikle soğuk asetonla birkaç saniye süreyle (gerekli enzimlere bağlı olarak) hafifçe sabitlenir.

Parafin mumu bölümleri

Çoğu enzim, standart parafin mumu işlemenin etkilerine dayanmayacaktır ve bu nedenle bu hazırlama modu çoğu zaman yararlı değildir. Bununla birlikte, peroksidaz ve kloro-asetat esteraz, rutin parafin balmumu gömülmesine dayanmak için yeterince dayanıklıdır ve kolayca gösterilebilir. Diğer bazı enzimler, düşük erime noktalı mumlarla özel bir program kullanılarak kısmen öngörülebilir, ancak bu nadiren kullanılır.

Histokimyasal teknikler
Histokimyasal yöntemler
İmmünohistokimya işlem Basamakları
Histokimyasal Nedir
İmmünohistokimyasal
Histokimyasal ve immunohistokimyasal boyalar
İmmünohistokimyasal yöntemler nelerdir
Histokimyasal boyalar hangi amaçla kullanılır

Histokimyasal Teknikler

Bu histolojik yöntemler, enzimlerin asla boyanmaması bakımından benzersizdir; sadece reaksiyon ürünleri gösterilmiştir. Anlamlı sonuçlar için, enzim reaksiyonunun dikkatli bir şekilde optimize edilmesi ve reaksiyon ürününün renklendirilmesi önemlidir.

Proses, bir birincil reaksiyon ürünü (PRP) oluşturmak için bir substratın dokuya bağlı enzim tarafından bölünmesini içerir. Bu PRP, daha sonra, çözünmez ve enzim bölgesinde olması gereken bir nihai reaksiyon ürünü (FRP) oluşturmak için bir tutma ajanı olarak bilinen bir kimyasal ile reaksiyona girebilir. Çok sayıda faktör reaksiyonları etkiler ve hepsi dikkatlice kontrol edilmelidir.

İnkübasyon solüsyonlarının pH’ı çoğu enzim reaksiyonu için kritiktir ve uygun tamponlar kullanılarak muhafaza edilir. Sıcaklığın değiştirilmesi enzim reaksiyon hızını değiştirebilir, bazı yöntemler 37 ° C’de inkübasyon gerektirirken diğerleri oda sıcaklığında gerçekleştirilir.

Optimal altı oda sıcaklığı, PRP ve yakalama ajanı ile FRP oluşumunun tamamlanması için daha fazla zaman sağlar, böylece enzim reaksiyon hızını düşürerek FRP’nin enzim bölgesine lokalizasyonunu geliştirir.

Substratlar ve tutucu ajanlar, etkileşimleri önlemek için seçilmeli ve her ikisi de hücre zarları boyunca kolayca yayılabilmelidir. Hem substrat hem de yakalama ajanı, hızlı enzim aktivitesi sırasında lokal tükenmeyi önleyecek bir konsantrasyonda kullanılmalıdır, ancak enzim reaksiyonunu inhibe edecek bir konsantrasyonda kullanılmamalıdır.

Bir yakalama ajanının seçimi, kullanılan enzim yöntemine ve enzimin içinde bulunduğu doku tipine bağlıdır. Örneğin, kas üzerinde metal çökeltme yöntemi kullanılırken, kurşun tuzuna kalsiyum tuzu tercih edilir, çünkü ikincisi kas ile spesifik olmayan bir şekilde bağlanabilir.

Çoğunlukla alt tabaka seçimi de vardır, ancak doğal olarak oluşan pek çok alt tabaka ucuz olsa da spesifik olmayabilir veya tamamen uygunsuz olmayan PRP’ler üretebilir. Özel olarak sentezlenen substratlar genellikle üstün sonuçlar verir.

Reaktiflerin kalitesinin ve kullanılan protokolün doğruluğunun değerlendirilebilmesi için histokimyasal boyama sırasında pozitif kontrol dokusunun dahil edilmesi önemlidir. Sübstratın inkübasyon ortamından çıkarılması veya spesifik inhibitörlerin dahil edilmesi, bir negatif kontrol görevi görecektir.

Enzim Reaksiyon Yöntemleri

Histopatolojide, çoğu enzim, (a) eşzamanlı bağlama veya (b) inkübasyon sonrası bağlama kullanılarak gösterilir.

Eşzamanlı bağlantı

Eşzamanlı bağlama, gerekli ko-faktörlerle hem substratı hem de bir yakalama ajanını içeren yalnızca bir çözüm gerektirir. Dokuya bağlı enzim, bir PRP üretmek için solüsyondaki substratla reaksiyona girer. Tutma ajanı (ayrıca çözelti halinde) bir FRP oluşturmak için anında PRP’ye bağlandığından, PRP çözünmez veya çözünür olabilir. Bu çözünmeyen FRP, enzim bölgesine bağlıdır ve renkli veya renksiz olabilir, ancak ikincisi görselleştirme için ek bir renklendirme adımı gerektirecektir.

İnkübasyon sonrası bağlantı

PRP üretimi için gerekli koşullar FRP üretimi için gerekli olandan farklı olabileceğinden, ara sıra substrat ve yakalama ajanının tek bir çözümde olması mümkün değildir. Bazen yakalayıcı ajan da enzim fonksiyonuna müdahale edebilir veya bunu inhibe edebilir. İnkübasyon sonrası birleştirme yöntemlerinde, ilk çözelti yalnızca substratı ve gerekli tüm yardımcı faktörleri içerir.

Üretilen PRP, yanlış negatifler veya FRP’nin brüt difüzyonu meydana geleceği için çözünmez olmalıdır. Yakalama ajanını içeren ikincil bir çözüm daha sonra yukarıdaki gibi FRP’yi üretmek için uygulanır. Pratikte inkübasyon sonrası birleştirme yöntemleri için uygun substratlar bulmak zordur ve bunun sonucunda nadiren kullanılır.

The post Histokimyasal Teknikler – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

Enzimler, çoğu biyolojik reaksiyon için katalizör görevi gören ve insanda homeostazı korurken hücresel metabolizmada hayati öneme sahip olan büyük üçüncül proteinlerdir. Her biri belirli moleküller (alt tabakalar) üzerinde etki ederek belirli bir reaksiyonu katalize eden 700’den fazla bilinen enzim vardır. Ortaya çıkan reaksiyon ürünü, Krebs döngüsünde gösterildiği gibi farklı bir enzim için yeni bir substrat görevi görebilir. Her metabolik reaksiyondan sonra, her durumda enzim, diğer etkileşimler için değiştirilmeden bırakılır.

Biyokimyacılar, teşhis ve araştırma araştırmaları için vücut sıvıları, doku kültürleri ve rezeke edilen dokudan türetilen solüsyonlardaki enzim seviyelerini rutin olarak inceler. Bu, hastalık süreçlerinin saptanması ve izlenmesinde ve ilaca bağlı fizyolojik değişikliklerin değerlendirilmesinde değerli kanıtlar sağlar.

Bununla birlikte, biyokimyasal analizlerle elde edilen sonuçlar, dokularda bulunan heterojen bir hücre popülasyonu ile ilgilidir ve spesifik hücresel değerler vermez. Hücre içi enzim konumu ve biyolojik aktivitenin daha doğru bir değerlendirmesi, enzim histokimyası kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Bu, doku kesitlerine veya lekelere bir enzim saptama sisteminin uygulanmasına dayanır. Bu teknik, enzim aktivitesi ile orantılı bir yoğunluk ile hücrelere lokalize olan son bir renkli reaksiyon ürünü üretir.

Biyokimyasal yöntemlerin aksine, bu yoğunluğun ölçülmesi zordur, ancak deneyimli bir patolog tarafından görülen kalitatif mikroskobik görünümler, çeşitli hastalık süreçlerinin histolojik tespiti ve değerlendirilmesinde daha önemlidir.

Enzim histokimyası ile ilgili temel sorun, doku hazırlama ve histokimyasal boyama sırasında enzim fonksiyonunun tutulmasıdır. Spesifik enzimler için çok sayıda histolojik yöntem geliştirilmiştir ve bu yöntemler zor olmasa da, gerekli standart dışı doku işleme prosedürleri bu tekniklerin genellikle uzmanlaşmış laboratuvarlarda uygulanmasına neden olmuştur.

Standart parafin kesitlerinde enzim tespiti için diğer enzim dışı histokimyasal yöntemler arasında immüno-histokimya ve mRNA in situ hibridizasyon yer alır. Bu yöntemler, hücresel enzimlerin varlığını veya üretimini belirleyebilir, ancak hiçbiri enzimin biyolojik aktivitesini gösteremez.

Patoloji histokimyasal boyalar
Histokimyasal yöntemler
Histokimyasal ve immunohistokimyasal boyalar
İmmünohistokimyasal bulgular
Histokimyasal teknikler
Histokimyasal boyalar hangi amaçla kullanılır
Histokimyasal boyama en sık kullanılan
İmmünohistokimya işlem Basamakları

Yapı ve Sınıflandırma

Yapısı

Enzimler, sitoplazma içinde serbest bulunabilen (liso-enzimler) veya hücresel zarlara (desmo-enzimler) bağlanan yüksek moleküler ağırlıklı globüler proteinlerdir. Aktif bir dördüncül yapı oluşturmaya yardımcı olabilecek enzime protein içermeyen bileşenler (prostetik gruplar) bağlanabilir. Enzimin fonksiyonel özelliği, enzim / substrat etkileşimi sahasındaki “aktif bölgesinin” şeklini ve yükünü korumasına bağlıdır.

Çoğu enzim reaksiyonu için çeşitli ko-faktörler gereklidir. Kalsiyum, manye- siyum, manganez, sodyum, potasyum iyonları ve diğerleri gibi aktivatörler enzimatik reaksiyon sırasında elektron transferine yardımcı olur.

Ko-enzimler, aktif olmayan bir “apoenzim” ile birleşen ve apoenzimin kuaterner yapısını değiştirerek sterik olarak aktif bir bölge üreten moleküllerdir. Ko-enzim ayrıca substrat ile birleşebilir ve metabolik reaksiyonda aktif bir rol oynayabilir. B vitaminlerinin çoğu ko-enzimlerdir.

Sınıflandırma

Enzimleri sınıflandırmanın birkaç yolu vardır, en doğrusu enzimin sistematik adına dayalı olarak enzim kod numarasıdır. Bu, reaksiyona girilen spesifik substratın adını ve ardından “ase” son ekiyle, ilgili reaksiyon türünü belirten bir kelimeyi içerir. Tanısal enzim histokimyasında, araştırılan enzim sayısının az olması nedeniyle daha kısa önemsiz bir ad daha yaygın olarak kullanılmaktadır.

Altı ana enzim grubu, substrat üzerindeki etkilerine göre sınıflandırılır; oksidoredüktazlar, transferazlar, hidrolazlar, liyazlar, izomerazlar ve ligazlar. Muhtemelen, teşhis enzimi histokimyacı için en önemli gruplar oksidoredüktazlar (daha önce oksidazlar ve dehidrojenazlar olarak biliniyordu) ve hidrolazlardır. Bunlar genellikle sırasıyla “oksidatif” ve “hidrolitik” enzimler olarak adlandırılır.

Koruma ve Hazırlık

Enzim koruması

Fiksasyon, dehidrasyon ve parafin mumuna gömme gibi geleneksel bir parafine gömülü doku bloğunun üretiminde gerekli olan işleme aşamalarının kümülatif etkileri, fonksiyonel enzimlerin korunmasına elverişli değildir.

Kloroasetat esteraz ve peroksidaz parafin işlemeden kaynaklanan hasara yeterince dirençli olmasına rağmen, bu prosedürler genellikle enzim aktivitesinin tamamen kaybıyla sonuçlanır. Sonuç olarak, çoğu enzimin gösterileri genellikle donmuş bölümler üzerinde gerçekleştirilir, ancak lekeler gibi diğer preparatlar da kullanılabilir.

Çeşitli enzimlerin dış etkilere farklı tepki verdiğini hatırlamak önemlidir, ancak taze doku oda sıcaklığında bırakılırsa çoğu enzim hızla kaybolur. Kas hastalığını araştırırken tanısal olarak önemli olan birçok oksidatif enzim mitokondride de bulunur.

Taze doku oksijenden mahrum kaldığında, mitokondriyal zarlar hızla zarar görür ve enzim aktivitesinde azalma meydana gelir. Bu nedenle, oksidatif enzimlerin çoğu geleneksel fiksasyona dayanamadığı için, genellikle taze olan dokuyu hızla dondurmak da önemlidir.

Hidrolitik enzimler lizozomlarda bulunur, ancak donma ve ardından blokların veya bölümlerin enzimlerin salınmasıyla çözülmesiyle zarar görürler. Hidrolitik enzimlerin difüzyonu en aza indirilebilir ve doku kriyotomiden önce bir fiksatif ile tedavi edilirse lokalizasyon iyileştirilebilir, ancak enzim aktivitesinde bir miktar kayıp meydana da gelecektir.

Uygulamada, enzim histokimyasal boyama, özellikle tanıda bir gecikmenin istenmediği veya aynı numunede farklı enzimlerin gösterilmesinin gerekli olduğu klinik durumlarda, genellikle sabitlenmemiş kriyostat bölümleri üzerinde gerçekleştirilir. Bununla birlikte, bazı enzimlerin lokalizasyonu, kriyotomi sonrası doku bölümünün kısaca sabitlenmesi ile de iyileştirilebilir.

Fiksasyon uygulanırsa, fiksatif 4 C’de olmalı ve mümkün olan en kısa süre kullanılmalıdır. Formol kalsiyum, çoğu durumda tamponlu formalin veya formal salin tatmin edici olmasına rağmen, hücre zarı bütünlüğünün korunmasına yardımcı olduğundan, doku blokları için sıklıkla tavsiye edilir. Kriyotomi ve enzim aktivitesi, sabitlenmiş dokunun donmadan önce bir sükroz tampon çözeltisi içinde yıkanmasıyla daha da geliştirilebilir.

Optimal sonuçlar için, bu solüsyonların dokunun fizyolojik pH’ına yakın tutulması önemlidir. Aseton, formalin buharı ve formalin-alkol karışımları dahil olmak üzere, smear ve kriyostat kesitlerinde formol kalsiyumun yanı sıra çeşitli fiksatifler de kullanılmıştır.

The post Enzim Histokimyası – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).