Mod, sabit fazdaki gözeneklerin farklı moleküler boyutlara sahip moleküllere erişilebilirliğine dayanır ve proteinler, karbonhidratlar ve lipidler gibi yüksek molekül ağırlıklı biyolojik örnekler için özel bir uygulamaya sahiptir. Daha küçük bileşenler gözeneklere daha fazla nüfuz edebilir ve bu nedenle gözeneklerden hariç tutulan daha büyük moleküllere göre kolon üzerinde daha uzun süre tutulur.

Adsorpsiyon Kromatografisi

Bu modda, silika (veya bazen alümina) genellikle sabit faz olarak kullanılır, ancak bu yöntem biyolojik numuneler için yaygın olarak kullanılmaz ve genellikle bağlı normal faz sabit fazlarla değiştirilir. Yöntem, mobil faz ve sabit faz için numunenin farklı afinitelerine dayanır.

 Bölme Kromatografisi

Tüm uygulamaların% 90’a kadarı, iki karışmayan sıvı faz arasında çözünen maddelerin bölünmesine dayanan bu kromatografi modunu kullanır; biri sağlam bir desteğe, diğeri mobil. En popüler sabit faz, oktadesilsilan (OD’ler veya C ,,) kaplı silika partikülüdür, ancak daha düşük homologlar (Cı, C,) de kullanılır.

Ters faz kromatografisinin popülaritesi, zincir uzunluğu, zincir tipi ve karbon yüklemesi bakımından değişen çok sayıda ticari ambalajın mevcudiyeti ile artmaktadır. Bu nedenle, kromatograf sadece hareketli faz bileşimini değiştirerek değişen seçicilik seçimine sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda farklı bir sabit fazı da seçer.

Kromatografiyi fazlamak mümkündür. İyonik yükler, tersine çevrilmiş pH kullanılarak hem iyonize edilmiş hem de iyonize edilmemiş ayrı çözünen maddelerin manipülasyonu veya bir iyon çifti reaktifinin dahil edilmesiyle bastırılabilir.

Daha polar bileşenler için, bağlı normal faz destekleri özellikle yararlıdır ve çözücü bileşimi değişikliklerine hızlı bir tepkiye izin vererek silika üzerinde adsorpsiyon kromatografisine göre faydalara sahiptir.

Ligand değişimi ve afinite kromatografisi gibi diğer bölme kromatografisi modları, suda çözünür biyomoleküllerin çözülmesi için özel uygulamalar bulmuştur.

Afinite kromatografisi
Jel Filtrasyon kromatografisi
İyon değişim kromatografisi
İyon exchange kromatografisi
Adsorpsiyon kromatografisi
Afinite kromatografisi çalışma prensibi
Hidrofobik etkileşim kromatografisi
İyon Kromatografisi

İyon Değişim Kromatografisi

İyon değişim kromatografisinde tutulma, çözünen maddenin karşıt yüklü grupları ile sabit faz arasındaki elektrostatik etkileşimler tarafından yönetilir. Seçicilik, mobil fazın doğasından veya sıcaklıktan etkilenebilir.

Özellikle çok bileşenli örnekler için belirli uygulamalar, bileşenleri yeterince ayırmak için birden fazla HPLC modu gerektirir ve bu, çok boyutlu HPLC kullanılarak sağlanabilir.

 Çözücü Seçimi

Bu bölüm, ilk ilkelerden mobil faz seçimine rehberlik etmek için tasarlanmıştır. Mobil faz bileşiminin seçimi, elde edilebilen büyük ölçüde farklı seçicilikler nedeniyle kritiktir. Bazı durumlarda, son seçimi, kullanılabilirlik ve gider gibi önemsiz faktörler belirleyebilir.

Uygun bir mobil fazın seçimi için esasen üç kriter vardır. Bunlar numunenin fizikokimyasal özelliklerine, çözücülerin fizikokimyasal özelliklerine ve örneğin TLC ile hareketliliğine (mümkünse) dayanmaktadır.

Numunenin Fizikokimyasal Özellikleri

Numune kolona ayırma için kullanılandan farklı bir çözücü içinde uygulanırsa olağandışı kromatografik etkiler gözlemlenebilir.

Örneğin, numune daha güçlü bir çözücü içinde çözülürse, o zaman sütun dengesinin bozulduğu bir bant, sütunda aşağı doğru ilerler ve çoğu zaman çözünürlüğü bozar. Bu nedenle, genel bir kural olarak, numunenin çözünür olduğu bir mobil faz seçmek ve çözünürlük sınırlayıcı bir faktör ise daha büyük bir enjeksiyon hacmi kullanmak her zaman en iyisidir.

Çözücülerin Fizikokimyasal Özellikleri

Çeşitli çözücülerin genel fizikokimyasal özelliklerini göstermektedir. Teoride, bu çözücülerden herhangi biri kromatografi için kullanılabilir, ancak pratik amaçlar için bir dizi çözücü genellikle çeşitli nedenlerle ortadan kaldırılabilir:

(a) yüksek viskoziteye sahip çözücüler, kromatografik kolondaki akış sırasında daha yüksek geri basınçlara neden olur,
(b) düşük kaynama noktalarına sahip çözücülerin hareketli fazda sabit bir konsantrasyonda tutulması zor olabilir ve ayrıca yangın tehlikesi oluşturabilir,
(c) yüksek UV kesme dalga boyuna sahip çözücüler, yaygın olarak kullanılan dalga boyu aralıklarında UV tespitini engeller,
(d) bazı çözücüler toksiktir (örneğin benzen) ve
(e) bazı çözücülerin saflığı partiden partiye değişebilir.

Bu nedenle, yalnızca sınırlı sayıda çözücü genel kullanıma sahiptir. Asetik asit ve trietilamin, bazen iyon değişim kromatografisinde kullanılan sulu tamponların hazırlanmasında kullanıldıkları için dahil edilmiştir.

Son olarak, esas olarak tutulmayı kontrol eden çözücü mukavemeti olsa da, protik çözücülerdeki hidrojen bağının da tutmayı etkileyebileceğine dikkat edilmelidir.

 Numunenin TLC’ye Göre Hareketliliği

Çoğunlukla tek bir çözücü, optimum kromatografik çözülmeye izin vermez ve ayırmaların çoğu, mobil faz olarak çözücülerin bir karışımını kullanır. Optimum mobil faz seçimi genellikle deneme yanılma yoluyla belirlenebilir, ancak TLC kullanılarak bazı kılavuz bilgiler de elde edilebilir.

Teorik olarak, bir TLC plakasındaki mobilite, k ‘= (1 – Rf) / Rf olduğundan, HPLC tutulmasıyla doğrudan ilişkilidir, ancak, TLC dengesiz bir işlem olduğundan ve genellikle daha düşük çözücü kuvvetleri gerektiğinden pratikte farklılıklar vardır. eşdeğer bir HPLC ayırması için. Bununla birlikte, TLC hareketliliği, birçok çözücü karışımını karşılaştırmak için hızlı bir yöntem de sağlar.

Genel olarak, bir numune karışımının ayrıştırılmasının geliştirilmesinde, numune başlangıçta düşük elüsyon kuvvetine sahip bir çözücü içinde HPLC kolonuna enjekte edilir ve daha sonra ilgili bileşikler kolondan ayrılıncaya kadar sürekli olarak da arttırılır.

Bu yöntemin temel sınırlaması, elüsyonun gerçekleştirilmesinin uzun zaman alabilmesi ve sonuç olarak, bu prosedürü, eluent kuvvetinde farklı sıçramalar ile tersine kullanmanın genellikle daha hızlı olmasıdır. Modern ekipman, gradyan geliştirmenin gözetimsiz yürütülmesine izin verir.

Birçok üretici, korozyon olasılığı nedeniyle paslanmaz çelik pompalarda düşük pH değerinde halojenür iyonlarının kullanımından kaçınılmasını önermektedir. Bu nedenle, halojenür iyonlarının kullanıldığı yerlerde, kullanılmadığında sistemden su ile yıkanmaları da tavsiye edilir.

Halide iyonları kullanılırken, pompanın haftada en az bir kez 20 dakika süreyle sistemden (kolondan değil!)% 20 nitrik asit solüsyonu pompalanarak da geçirilmesi tavsiye edilir.

The post İyon Değişim Kromatografisi – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

Bu prosedür, numunenin elüsyonuna ve ligandın aktivitesinin geri kazanılmasına izin verir. Bağın liganda bağlanması muhtemelen bir polimer için çok değerlikli olacaktır (yani çok bölgeli bağlantı) ve bu nedenle sterik olarak bağımlı olabilir.

Tutulmayı etkileyen kritik özellikler, ligand-bağ kompleksi için ayrışma sabiti (Kd) ve durağan fazdaki ligand konsantrasyonudur (bağlanma yerlerinin sayısı). Ayrışma sabiti (Kd), kütle eylem oranı ile tanımlanır.

Afinite kromatografisi için kapasite faktörü (k ‘), basitçe, belirli bir kolon için bağlanmanın serbest bağlantıya oranı olarak tanımlanır ve denklem ile gösterilebilir.

Kd ve k ’arasındaki bir ilişki, analitik ayrımlarda olduğu gibi [Ln]> [Lt] olduğunda türetilebilir. Bu ilişki, çok değerlikli bağlanma için dikkate alınmıştır. Plaka yüksekliğinin K’ye bağımlılığı, concanavalin A’nın eklendiği bir silika desteği kullanılarak not edilmiştir.

Sabit Faz Etkileri

Ligand bağlanmasının kimyası

Ligandların geleneksel sabit fazlara bağlanması için çeşitli yayınlanmış yöntemler mevcuttur ve yüksek performanslı afinite kromatografisi için uygun olan sabit fazların çoğu, bu yöntemlerden bazıları kullanılarak hazırlanmıştır.

Çoğu prosedürde, silika, daha sonra bir reaktif aminin kovalent olarak bağlanabildiği hidrofilik bir tabaka (glikofaz) ile kaplanır. En kararlı destekler ya epoksilika birleştirme ya da tresil-klorür ile aktive edilmiş silika tarafından üretilir.

Diğer özellikler

Parçacık şeklindeki gelişmeler kütle aktarım hızını iyileştirirken desteğin artan sertliği elüsyon ve yeniden dengeleme sırasında daha hızlı akış hızlarına izin verdi. Başarılı ayırmaların çoğunun, sabit faz için bir temel olarak geniş gözenekli (50-100 um) silika partiküllerini kullandığını ve böylece herhangi bir sterik engelden kaçındığını belirtmek de gerekir.

Geleneksel destekler üzerinde yapılan ilk çalışmalardan, bir ara kolun varlığının, muhtemelen ligandın reaktif bölgelerine erişim özgürlüğüne izin vererek bağın bağlanması için faydalı olduğu bulunmuştur. Bununla birlikte, bu kollar ligandın bağlanmasına katılmamalıdır ve bu nedenle hem hidrofilik hem de iyonik olmamalıdır.

Konvansiyonel afinite desteklerinde yüksek derecede ligand ikamesi sağlanabilmesine rağmen, bazı durumlarda bağlanma sırasında yanlış yönlendirme ve denatürasyon kombinasyonundan dolayı potansiyel bölgelerin sadece% 1-2’sinin bağlanma için mevcut olabileceği tahmin edilmiştir. 

Ek olarak, durağan faza bağlanabilen molar ligand miktarı, moleküler boyutun bir fonksiyonudur. Bu, bu tür sabit fazın kapasitesinin, iyon değiştirme veya ters faz sabit fazlardan 100 kat daha az olabileceği anlamına da gelir.

İmmünoafinite durağan fazların hazırlanması için bildirilen durumlarda ligand genellikle 5-10 mg / g reçine konsantrasyonunda bağlanır, ancak bir çalışmada alkol özellikle Cibacron Blue FG3-A’dır.

Bu molekül, enzimlerin katalitik aktivitesi için gerekli nükleotid kofaktörlerinin çoğunu taklit ettiği düşünülen sülfonatlı bir antrakinon parçası içerir.

Ham maya ekstrelerinden, ilgili substratları kullanılarak seçici elüsyonla izole edilen iki enzim, heksokinaz ve 3-fosfogliserat kinaz için bu tip desteğin çözülme gücünün dramatik bir kanıtı gösterildi.

Afinite kromatografisi
Hidrofobik etkileşim kromatografisi
İyon değiştirme kromatografisi
Afinite kromatografisi çalışma prensibi
Jel Filtrasyon kromatografisi
Kromatografik yöntemler
Adsorpsiyon kromatografisi
Kolon kromatografisi

İmmünoafinite

Poliklonal antikor preparatlarının çoğu, Kd = lop8 ila lo – ‘* M sırasıyla ayrışma sabitlerine sahiptir. Bu, maksimum seçiciliğe izin verirken, ligand-bağlayıcı ayrılması, kromatografi sırasında hız sınırlayıcı hale gelebilir, dolayısıyla HPLAC’de kullanımları, hızın gerekli olduğu yerlerde avantajlı olarak kabul edilmeyebilir.

Başarılı bir kromatografiye izin vermek için 0,05-0,1 ml / dk mertebesindeki akış hızları gerekli olabilir ve bu, antikor ligandlarının yüksek performanslı desteklere bağlanma amacını ortadan kaldırabilir. Daha düşük bağlanma sabitlerine sahip monoklonal antikorları seçme olasılığı, tercih edilen bir alternatif sunabilir.

Tablo 9.1, ticari olarak iki sınıfa ayrılan daha popüler afinite ligand tiplerini göstermektedir: katı bir şekilde biyospesifik olarak kabul edilenler ve yapısal veya fonksiyonel bir homolojiyi paylaşan molekülleri ayıranlar. Afinite ligandlarının kapsamlı bir listesi başka bir yerde sunulmuştur, ancak liste sürekli olarak büyümektedir.

Mobilephase efektleri

Seçicilik, nihai olarak ligand-bağ etkileşiminin özgüllüğü ile belirlenir. Bağlanma büyük ölçüde stereospesifik etkileşimler tarafından yönetilse de, Kd elektrostatik, hidrofobik ve bu tür diğer etkileşimlere bağlı olacaktır ve bu nedenle pH ve iyonik kuvvet gibi mobil faz özelliklerinden de etkilenecektir.

Ligand-bağ etkileşiminin kinetik çalışmaları, ligandı birleştirmek için kullanılan farklı yöntemlerden veya ligandın destekten sızmasına bağlı olabilecek çelişkili sonuçlar göstermiştir. (Ligandın destekten sızması, farmakolojik olarak aktif bileşiklerin üretimi için büyük ölçekli afinite desteklerinin kullanımında bir dezavantaj olmuştur.) Kd üzerindeki çözüm çalışmaları, sıcaklık arttıkça Kd’de bir artış olduğunu göstermektedir. ve buna karşılık gelen k ‘değerinde bir azalma olur.

Yüksek Performanslı Ligand Değişim Kromatografisi (HPLEC)

Yüksek performanslı ligand değişim kromatografisinin (HPLEC) geliştirilmesi, HPLAC’den oldukça farklıdır. İvmenin çoğu, amino asitlerin rasemik formlarını ayırma girişimlerinden de kaynaklandı.

Bir yaklaşım, amino veya karboksil grubunun modifikasyonu ve ardından normal faz kromatografisi yoluyla amino asitleri diastereomerik karışımlara dönüştürmekti. Popüler türevlendirme ajanları, izotiyosiyanat ve tiyoüre bileşikleridir.

Halen popüler olmasına rağmen, bu yaklaşım reaksiyon sırasında uzun türetme ve olası artefakt oluşumu dezavantajına sahiptir. Diğer bir yaklaşım, normal veya ters faz kromatografisi sırasında da mobil faza bir kiral ajan eklemektir.

Daha yakın zamanlarda, bir kiral ajanın kovalent olarak bağlanması için durağan fazlardan artan şekilde yararlanılmıştır. Aşağıdaki bölümler bunlarla ilgilenecektir.

Prensipler

HPLEC’in en popüler modu, bazen metal şelat kromatografisi olarak anılır. HPLEC’de bir çözünen maddenin (Lt) tutulması, bir metal iyon-bağ kompleksinin oluşumuna bağlıdır.

Metal iyonun kendisi, durağan faz (SM) ile oluşturulan bir koordinasyon kompleksine bağlıdır. Sabit fazın metal iyon bağlayıcı kompleksi (SMLt) tersine çevrilebilir ve oldukça da düzenli bir yapıya sahiptir.

The post Ligand Değişim Kromatografisi – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).