Ekipman

Hücre içi PCR gerçekleştirmek için, standart bir termal döngüleyici (değişiklikler kullanarak), termodöngü fırınları ve özel olarak tahsis edilmiş termo döngüleyiciler (Applied Biosystems Gene Amp in situ PCR sistemi 1000; Hybaid Omnigene/ Omnislide ve MJB slayt termocycler) arasında değişen çeşitli araçlar mevcuttur. hücre içi DNA ve RNA amplifikasyonu için kullanılır.

Standart bir termal döngüleyici kullanılıyorsa, slayt için bir amplifikasyon odası oluşturulmalıdır. Bu alüminyumdan yapılabilir (alüminyum folyo tekne). Sürgüyü içeren bu tekne, termal döngüleyiciye yerleştirilir, mineral yağ ile kaplanır ve ardından tamamen sarılır. Ancak, ısıl iletimin optimizasyonu hiçbir zaman tam olarak sağlanamaz.

‘Termal gecikme’, yani In situ immüno-PCR’deki farklılıklar: in situ immünoanalizler, in situ PCR ile erişilebilen hedef moleküllerin dakika sayısının saptanmasına izin vermez. In situ immüno-PCR, DNA markörünün bir antikor-biyotin-avidin köprüsü aracılığıyla hedef moleküllere bağlandığı ve in situ PCR ile amplifiye edildiği bir reaksiyondur. Amplifiye edilmiş DNA dizileri daha sonra hibridizasyon ile yerinde tespit edilir.

Bu tekniğin yaratıcıları, tekniğin bozulmamış hücrelerde veya doku kesitlerinde proteinler, karbonhidratlar ve lipidler gibi biyolojik makro moleküllerin çok küçük miktarlarını tespit edebilen tek teknik olabileceğini iddia ediyor.

Reaksiyon döngüsünün her bir sıcaklık adımında blok yüzü, cam slayt ve PCR reaksiyon karışımı arasındaki sıcaklıkla yaygın olarak karşılaşılır. Bu problem, daha büyük termodinamik kontrol ile dahili slayt sıcaklık kalibrasyon eğrileri sunan, özel olarak tasarlanmış yerinde amplifikasyon makinelerinin kullanılmasıyla aşılır.

Amplifikasyon Tıp
Gen amplifikasyonu
Hedef amplifikasyon nedir
Elektronik amplifikasyon nedir
Sinyal amplifikasyon nedir
Pcr amplifikasyon nedir
Sinyal amplifikasyonu ne demek
Her2 gen amplifikasyonu nedir

Başlangıç ​​Malzemesi

1990 yılında Haase ve ark. başlangıçta in situ PCR, PCR reaksiyon tamponunda süspanse edilmiş, bozulmamış sabit tek hücrelerde tarif edilmiştir. Amplifikasyondan sonra hücreler cam slaytlar üzerinde sitosantrifüjlendi ve amplifiye edilen ürün in situ hibridizasyon kullanılarak saptandı.

Başlangıçta, bazı araştırmacılar standart Eppendorf tüplerinde doğrudan PCR reaksiyon tamponunda inkübe edilen cam slayt parçaları (sitosantrifüj preparatlarından hücrelerle) kullandılar. Daha yakın zamanlarda, mikroskop slaytlarına bağlı doku ve hücreleri kullanan teknikler kullanılmıştır.

IS-PCR, PCR-ISH, IS-LCR, IS-PNA PCR ve IS-TaqMan PCR için, amplifikasyon için arşiv parafine gömülü materyal dahil sabit hücreler ve dokular kullanılabilir. Eski arşiv materyali (40 yıla kadar) ile başarılı amplifikasyon elde edilmiş olmasına rağmen, en iyi sonuçlar taze sabitlenmiş hücreler ve dokularla elde edilir.

Sabit metafaz kromozom yayılımları ve interfaz çekirdekleri, PRINS ve döngüsel PRINS kullanılarak spesifik alt kromozomal bölgelerin tespiti için kullanılabilir (Gosden ve diğerleri, 1991). Amplifikasyon reaktiflerine en az amplifiye ürün sızıntısı ile erişime izin veren uygun bir mikro ortam sağlayan sert bir hücresel hücre iskeleti oluşturulmalıdır.

%1-4 paraformaldehit, nötr tamponlu formaldehit (NBF) ve %10 formalin içinde sabitlenmiş dokularla tatmin edici sonuçlar elde edilir (biyopsi/katı doku için 12-24 saat; sitolojik hazırlıklar için 10-30 dakika). Etanol ve asetik asitle sabitlenmiş dokularla daha az tutarlı sonuçlar elde edilir.

Hücrelerin formaldehit fiksatifleri ile fiksasyonu bir takım dezavantajlar sağlar. Aldehit grupları, DNA-DNA ve DNA-histon protein çapraz bağları oluşturmak için DNA ve histon proteinleri ile reaksiyona girer. Formaldehit fiksasyonu ayrıca künt uçlu olmayan (yani örtüşmeyen uçlar) DNA şablonunu (dsDNA’da rastgele kırılmalar) “çentikler”.

Bu çentikler daha sonra Taq DNA polimeraz için potansiyel hazırlama bölgeleri olarak hareket edebilir ve apoptoz için in situ uç etiketlemeye benzer şekilde etiketli ve etiketsiz nükleotidlerin (yani dATP vb.) dahil edilmesine ve uzamasına yol açar.

Bu işlem oda sıcaklığında gerçekleşir ve DNA IS-PCR ile sahte sonuçlara yol açar. Hücre içi DNA ve RNA PCR’nin (yani bir hibridizasyon aşaması olmadan) büyük ölçüde terk edilmesinin baskın nedeni budur.

Yerinde amplifikasyon sırasında tekrarlanan ısıtma ve soğutma döngüleri kullanıldığından, hücreler ve dokular, ayrılma meydana gelmemesi için katı bir desteğe (genellikle cam) yeterli şekilde bağlanmalıdır. Cam slaytlar, en yaygın olarak aminopropil-trietoksisilan (APES), Denhardt solüsyonu ve Elmer yapıştırıcısı olan maksimum kesit yapışmasını sağlamak için kaplama ajanları ile ön işleme tabi tutulur.

Hücre ve doku geçirgenliği

Reaktiflerin erişimini kolaylaştırmak için hücreler yeterince sindirilmeli ve geçirgenleştirilmelidir. Bu, proteaz muamelesi (örneğin, proteinaz K, pepsin veya tripsin) ve/veya hafif asit hidrolizi (0.01-0.1 N HCl) ile elde edilebilir. Maksimum sindirim süreleri ve proteaz konsantrasyonları, kullanılan her doku/sitolojik preparasyon için optimize edilmelidir.

Uzun sindirim süreleri kaçınılmaz olarak hücresel morfolojiyi tehlikeye atar. Kısa sindirim süreleri, sonuçta doğal DNA şablonları boyunca Taq DNA polimerazın ilerlemesini engelleyebilecek olan histon protein-DNA çapraz bağlarının eksik ayrışmasıyla sonuçlanır. Asit hidrolizi muhtemelen bu tür çapraz bağları tam ayrışmaya yönlendirerek etki eder.

Alternatif olarak, nükleik asit şablonlarını açığa çıkarmak için hücrelerin ve doku bölümlerinin mikrodalga ışınlaması kullanılabilir. İmmünositokimya için antijen alımına benzer bir sitrat tamponu kullanılarak kısa mikrodalga ışıması (proteolizli veya proteolizsiz) darbeleri, amplifikasyon reaktiflerinin istenen hedef diziye erişmesine izin verir ve ayrıca amplifikasyon sonrası immünositokimyayı kolaylaştırır.

Bunu takiben (izotopik olmayan bir etiketleme yöntemi kullanılıyorsa), ürünün amplifikasyon sonrası tespiti için kullanılan yönteme bağlı olarak bir bloke etme adımı kullanılmalıdır, örn. peroksidaz veya alkalin fosfataz tespit sistemleri. İlkinde, endojen peroksidaz, sodyum azid ile %3’lük bir H2O2 solüsyonunda inkübasyon yoluyla söndürülürken, %20 buz gibi soğuk asetik asit, intestinal alkalin fosfatazı bloke eder.

DNA amplifikasyon protokolleri

Başarılı amplifikasyon aşağıdakiler tarafından yönetilir: (a) döngü parametrelerinin dikkatli optimizasyonu; (b) primer çiftlerinin uygun tasarımı (Tm’leri, yani spesifik erime sıcaklıkları, primer dimerleri oluşturma yetenekleri ve benzersizlikleri dikkate alınarak); ve (c) amplifikasyon reaksiyonunu yürütmek için gerekli olan Mg2+ konsantrasyonlarının optimizasyonu yer alır.

The post Amplifikasyon – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).