Amplifikasyon reaktifi hacimleri, kullanılan hücre preparasyonu/doku bölümünün yüzey alanına bağlı olarak genellikle değişir. Bu önemlidir, çünkü lokalize amplifikasyon başarısızlığına bağlı olarak hacim değişimlerinden dolayı lamın yüzeyinde yamalı amplifikasyon meydana gelebilir. Gene Amp in situ PCR 1000 sistemini kullanırken, tipik olarak 25-50 ml kullanılır.

DNA’nın ilk denatürasyonu, amplifikasyondan önce, permeabilizasyon sırasında veya fiksasyon prosesini takiben gerçekleştirilebilir. Alternatif olarak, amplifikasyon protokolünün başlangıcında gerçekleştirilebilir. Denatürasyon ısı, ısı/formamid veya alkali kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Ek olarak, çoğu araştırmacı yanlış hazırlamayı ve primer oligomerizasyonunu azaltmak için ‘hot start’ PCR kullanımını savunmaktadır ve Nuovo (1994), E. coli’den türetilen tek zincirli bağlayıcı proteinin (SSB) eklenmesini önermiştir. Bu proteinin kesin etki şekli bilinmemekle birlikte, DNA replikasyonu ve onarımında primerin yanlış hazırlanmasını ve oligomerizasyonu önleyerek işlev görür.

Döngü parametrelerinin optimizasyonu, her bir özel tahlil için gerçekleştirilmelidir. Çoğu protokol, istisnai olarak 50 döngü olmak üzere 25-30 döngü amplifikasyon kullanır. Bazı araştırmacılar, her tur arasında primerler ve DNA polimeraz dahil olmak üzere yeni reaktiflerin eklenmesiyle iki ardışık 30 döngü turu gerçekleştirmiştir; bunun bir modifikasyonu, ilk tur sırasında üretilen amplikon içinde “iç içe geçmiş” dahili primerlerin eklendiği “iç içe” PCR’dir. Ancak bu rutin kullanım için önerilmez.

Primer seçimi iki temel strateji etrafında gelişmiştir: tamamlayıcı kuyrukları olan veya olmayan tek primer çiftleri veya çoklu primer çiftleri. Amplikonların lokalizasyonu ve minimum ürün difüzyonunun bariz avantajı ile daha uzun/üst üste binen ürün üretmek için çoklu primer çiftleri tasarlanmıştır. Bununla birlikte, eğer ‘hot-start’ PCR kullanılıyorsa, başarılı amplifikasyonu sağlamak için genellikle tek primer çiftleri yeterlidir.

Azot fiksasyon ne demek
Fiksasyon Ne Demek TIP
CO2 fiksasyonu
Dokuların fiksasyonu
Fiksasyon Nedir dış
Fiksasyon Nedir
Azot fiksasyonu
Kontrast fiksasyonu ne demek

Amplifikasyon Sonrası Sıkı Yıkama ve Amplikon Fiksasyonu

Amplifiye edilmiş ürünün lokalizasyonunu korumak için %4 paraformaldehit ve/veya etanol ile sonradan fiksasyon kullanılabilir. PCR-ISH yapılıyorsa bu aşamada bir oligonükleotid veya genomik prob uygulanır. Maksimum özgüllük, yalnızca amplifiye edilmiş ürünün içindeki dizilere hibritlenen problar kullanılarak elde edilir. Genomik problar bu dizilerle sınırlı değildir ve karşılaştırılabilir sonuçlar veriyor görünmektedir.

Yerinde amplifikasyonun ardından, çoğu protokol, spesifik olmayan boyamaya ve yanlış pozitif oluşumuna neden olabilen dağınık hücre dışı ürünü çıkarmak için sodyum klorür, sodyum sitrat (SSC), formamid ve değişen yıkama sıcaklıklarını kullanan bir amplifikasyon sonrası yıkama adımını içerir. 

Yıkamanın “sıkılığı”, kullanılan koşullar kümesiyle tanımlanır (yani, SSC konsantrasyonu, kullanılan formamid yüzdesi ve yıkama sıcaklığı). Araştırmacı, sinyalin: arka plan gürültü oranının maksimum olduğu; ancak hibridizasyon sonrası yıkama sertlikleri ampirik olarak türetilir.

Amplikonların tespiti

İzotopik olmayan işaretler (örneğin biyotin, digoksigenin, floresein) daha yaygın olarak kullanılır ve bir “sandviç” immünohistokimyasal tespit tekniği ile birlikte kullanıldığında, izotopik işaretlere benzer derecelerde tespit hassasiyeti sağlıyor gibi görünmektedir. Bunlar, geleneksel immünositokimyada olduğu gibi, bir adımdan beş adıma kadar olan algılama sistemleri arasında değişebilir.

Ürün son olarak bir renk reaksiyonu (örn. NBT/BCIP veya AEC kromajenler) veya floresan ile görselleştirilir. Nuovo, amplifikasyon sonrası konvansiyonel immünositokimyanın performansını tanımlamıştır, bariz avantajı ürünün ilgili hücre ile birlikte lokalizasyonudur, örn. endotel hücresi veya makrofaj.

Bununla birlikte, bizimki de dahil olmak üzere çeşitli gruplar tarafından bunu yeniden üretme girişimleri hayal kırıklığı yaratmıştır ve çoğu epitopun tekrarlayan termal döngüye dayanmaması muhtemeldir.

Hücre içi DNA PCR testleriyle kullanım için reaksiyon, doku ve saptama kontrolleri

Paralel çözelti fazlı PCR, primerlerin ve/veya Taq DNA polimerazın çıkarılması, alakasız primerler ve/veya problar, bilinen negatif kontroller ve referans kontrol genleri her tahlilde gerçekleştirilmelidir. Gerçekleştirilen kontrollerin sayısı, reaksiyon için mevcut doku/hücre miktarına bağlıdır.

PCR-ISH’de aşağıdaki kontroller gereklidir: (a) referans kontrol geni PCR-ISH, örn. -globin, -aktin, vb; (b) hedef dokuların/hücrelerin DNaz sindirimi; (c) hedef dokuların/hücrelerin RNaz sindirimi; (d) alakasız problu hedef primerler; (e) hedef problu alakasız primerler; (f) alakasız problu alakasız primerler; (g) hedef problu referans kontrol geni primerleri; (h) yalnızca hedef primer bir, (asimetrik hücre içi PCR); (i) yalnızca hedef primer iki; (j) Taq polimeraz yok; (k) primer yok; (l) RT IS-PCR veya RT PCR-ISH’de ters transkriptaz adımını atlayın; (m) PCR-ISH ve RT PCR-ISH için in situ hibridizasyon kontrolleri; ve (n) immünositokimyasal saptama sistemleri için saptama kontrolleri.

PDH gibi tek kopya bir memeli geninin kullanımı dahil olmak üzere referans kontrol genleri, doku bölümü/hücre preparasyonundaki amplifikasyon derecesini değerlendirmek için önemlidir. DNA hedeflerini yükseltirken, DNAazların eklenmesi sinyali ortadan kaldırmalıdır. Bu gerçekleşmezse, sinyal sahte amplifikasyondan kaynaklanmış olabilir veya alternatif olarak RNA/cDNA’yı temsil edebilir.

RNAse ön tedavisi, RNA hedeflerinin [in situ ters transkriptaz (RT) PCR] değerlendirilmesinde zorunludur ve hücresel RNA’dan kaynaklanan yanlış pozitif sinyalleri en aza indirmek için DNA şablonlarının amplifikasyonuna dahil edilmelidir. Grubumuz, RNAase A ve T1 kombinasyonunun üstün sonuçlar verdiğini bulmuştur.

Hedefe özgü prob ile bağlantılı olarak bir referans kontrol gen primer çiftinin kullanılması, hedef prob dizisinin “yapışkanlık” derecesini ve bir yanlış pozitif sonucun oluşturulmasını değerlendirir.

Amplifikasyon karışımına yalnızca bir primerin eklenmesi, sentezlenen ürün miktarında nicel bir azalma ile bir “asimetrik PCR” oluşturur. Alakasız problu alakasız primerler bir sinyal üretmemelidir. PCR-ISH’nin in situ hibridizasyon bileşeninin özgüllüğü, hedefe özgü primerler ile alakasız bir prob kullanılarak değerlendirilir.

Yanlış pozitif sinyallerin üretilmesinde primer-primer dimerizasyonu ve primer oligomerizasyonunun rolü Taq DNA polimerazı hariç tutularak değerlendirilirken, doku kesitlerinde çentikli DNA’nın spesifik olmayan uzamasının katkısı primerlerin dışlanmasıyla incelenir.

İkincisi, ISH-PCR için son derece önemli bir kontroldür. RT-IS PCR değerlendirmesinde, ters transkriptaz adımının atlanması önemlidir. Rutin in situ hibridizasyonda olduğu gibi, hibridizasyon kontrolleri ve tespit kontrolleri, ISH adımının başarısızlığından veya tespit sistemi tarafından dokuların anormal boyanmasından kaynaklanan yanlış pozitif/negatif sonuçları dışlamak için gereklidir.

The post Fiksasyon – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).

Islak Fiksasyon

Islak fiksasyon, protoplazmayı kurutur ve proteini, genellikle daldırma veya kaplama yoluyla alkol bazlı bir sıvı kullanarak koagüle eder. Bu tür bir sabitleme, son preparasyonda bir derece hücre küçülmesine neden olur. Carnoy sıvısı seçici olarak eritrositleri parçalamaktadır ve ağır kan lekeli örneklerde yardımcı olabilir. Diğer fiksatifler, ör. glutaraldehit veya formalin, belirli koşullar altında tercih edilebilir. Alkol içerisindeki polietilen glikol, posta gönderimi için koruyucu bir mumsu kaplama sağlar ve sonraki boyamadan önce iyice çıkarılmalıdır.

Hava ile Kurutma

Havayla kurutma, hızlı olması gereken buharlaşmaya dayanır ve en iyi şekilde pasif olmaktan ziyade slayt üzerindeki zorla hava hareketi ile kolaylaştırılır. Bu yöntem, ıslak sabitlemeye kıyasla hücreleri görünür bir genişleme ile düzleştirme eğilimindedir. Hava ile kurutulmuş preparatlar, çapraz enfeksiyon tehlikelerini önlemek için kurutulduktan sonra neredeyse her zaman metanol içinde sonradan sabitlenir.

İnce iğne aspirasyonunu takiben kist sıvısı veya iğne yıkamaları gibi materyaller taşıma ortamında alınabilir. Herhangi bir taze biyolojik numunenin laboratuvar personeli için potansiyel bir biyolojik tehlike oluşturduğu unutulmamalıdır ve önerilen sağlık ve güvenlik önlemlerine her zaman uyulmalıdır.

İntraoperatif konsültasyon Nedir
Fiksasyon Nedir
Perfüzyon fiksasyonu nedir
Fiksasyon yöntemleri nelerdir
Dokuların fiksasyonu
Fiksasyon Nedir Patoloji
Fiksasyon çeşitleri nelerdir
Fiksasyon nasıl yapılır

Hücre konsantrasyon teknikleri

Santrifüjleme

Bu yöntem, seröz efüzyonlar, idrar veya tuzlu lavaj numuneleri gibi hacimli örnekler için uygundur.

Sitosantrifüj

Bu, hücrelerin lokalize bir tek tabakasını oluşturmak için doğrudan mikroskop slaytları üzerine döndürülen küçük sıvı alikotlarını kullanır. Düşük hacimli mütevazı hücresel örnekler için uygundur. Bununla birlikte, bazı materyaller kaçınılmaz olarak filtre kartında kaybolur. Viscid veya hücresel örnekler uygun değildir.

Membran filtrasyonu

Pozitif basınç veya vakumlu filtrasyon, önceden belirlenmiş gözenek boyutuna sahip çeşitli filtre türleri, örn. selüloz asetat veya polikarbonat. Çok çeşitli geniş hacimli veya hiposelüler sıvı örnekleri için uygundur ve santrifüjleme yöntemlerine göre daha fazla hücre yakalama sağlayabilir.

Hücre bloğu hazırlama

Hücreler doku benzeri bir durumda kümelenerek, geleneksel histoloji ile karşılaştırılabilir kesitlerin kesilmesini sağlar. Yöntemler arasında plazma kullanan plazma trombin pıhtısı ve sıcak agar ile agar hücre bloğu bulunur. Çoğu hücre süspansiyonu için uygundurlar ve immünositokimya dahil özel boyamaya izin verirler.

Sıvı bazlı sitoloji

Yukarıdaki sitoloji örneklerinin işlenmesi ve hazırlanmasına ilişkin tekniklerin iyileştirilmesi, uzun bir süre boyunca kademeli olarak yapılmıştır. Bununla birlikte, son yıllarda artan beklenti, özellikle en son teknolojik gelişmelerden yararlanmanın yollarını arayarak, geleneksel metodolojinin birçok yönünün eleştirel olarak yeniden incelenmesine yol açmıştır.

Sıvı bazlı sitoloji, bir tarama ve tanı yöntemi olarak sitolojinin duyarlılığını ve özgüllüğünü artırma arzusundan gelişmiştir. Üreticiye özel kılavuz, yarı otomatik veya tam otomatik protokollere dayanan bir dizi özel sistem şu anda mevcuttur.

Bununla birlikte, slaydın daha küçük bir alanını kaplayan homojen, daha temiz, daha düz bir numune üretmek amacıyla çalışma prensipleri büyük ölçüde benzerdir. Bu, tatmin edici olmayan örneklerin sıklığında eşlik eden bir azalma ile daha kolay ve daha hızlı taramayı kolaylaştırır. Teknoloji, hem jinekolojik hem de jinekolojik olmayan uygulamalara başarıyla uyarlanıyor.

Örnekler genellikle olağan şekilde toplanır ve bir hücre süspansiyonu oluşturmak için belirtilen taşıma veya koruma sıvısına aktarılır. Bazı sistemler, sıvıya parçalanan patentli fırçalar veya süpürgeler kullanır, böylece tüm numunenin yakalanmasını sağlarken, diğerleri hedef hücre popülasyonunu toplamak için bir durulama prosedürü kullanır.

Laboratuvarda materyal daha sonra kanı, enflamatuar ve proteinli eksüdayı uzaklaştırmak için işlenir. Süspansiyonun bir bölümü nihayetinde ince, homojen bir tabaka olarak bir cam slayt üzerine bırakılır.

Eşit dağılım, iyi hücre koruması, tutarlı hücre boyaması, gelişmiş mikroskobik ayrıntı ve artefaktlardaki azalma, geleneksel tekniklerle hazırlanan yaymalarla olumlu bir şekilde karşılaştırılır. Herhangi bir hücre sayfası ve grup daha küçük olma eğilimindedir ve arka plan öğeleri tarafından daha az şaşırtılır.

ThinPrep (Cytyc Corporation) yöntemi, bir filtre ile kaplı açık, tek kullanımlık bir plastik tüp etrafında ortalanır. Örnek, metanol bazlı bir ortamda toplanır ve santrifüjlenir. Hücre peletinden alınan bir numune daha sonra metanol bazlı bir koruyucu sıvıya aktarılır.

Hazırlamanın diğer üç ana aşaması vardır: birincisi, makine filtre tüpünü hücre süspansiyonu şişesine yerleştirir ve mukusu ve herhangi bir hücre kümesini dağıtmak için onu çalkalayarak hücre dispersiyonu; ikinci olarak, hafif bir vakum darbesinin, üzerine bir hücresel malzeme tabakasının bırakıldığı filtreden tüpe sıvı çekildiği hücre toplama.

Bazı kan, enflamatuar hücreler ve hücresel kalıntılar filtreden geçebilir ve hücre yakalanmasını optimize etmek için sıvı akışı izlenir; üçüncü olarak, filtre tüpü ters çevrildiğinde ve elektrostatik olarak yüklü bir kızağa hafifçe bastırıldığında hücre transferi.

Slayt hemen fiksatife daldırılır ve ardından manuel veya makine ile sonraki boyama için hazırdır. Tüm prosedür, 30 dakikanın altında nispeten hızlıdır ve çok az teknisyen zamanı gerektirir. Hücre birikim alanı 1.9 cm çapındadır ve 100.000 hücre mertebesinde içerir.

SurePath Prep (TriPath Imaging Inc.) yöntemi, örneğin etanol bazlı bir ortamda toplanmasıyla başlar. Laboratuvarda, flakon hücreleri dağıtmak için vortekslenir ve süspansiyon, yoğunluk gradyan santrifüjü yoluyla hücre zenginleştirme aşamasından geçer.

Bu aynı zamanda kan ve diğer kirletici kalıntıları da giderir. Süpernatan sıvı çıkarılır, hücre pelleti yeniden süspanse edilir ve ikinci kez santrifüjlenir. Hücre peletinin bir alikotu daha sonra robotik olarak bir çökeltme odasına aktarılır; burada hücrelerin, poli-L-lizin kaplı bir mikroskop lamı üzerinde ince bir tabaka oluşturmak için yerçekimi altında yatmasına izin verilir.

Makine daha sonra slaytları otomatik olarak boyar. Bu işlem yaklaşık 60 dakika sürer ve bir dereceye kadar manuel müdahale gerektirir. Dairesel çökeltinin çapı yaklaşık 1.3 cm’dir ve yaklaşık 100.000 hücre içerir.

The post Islak Fiksasyon – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).