Normal faz kromatografisi (NPC), proteinlerin saflaştırılması için çok az ilgi görse de, potansiyel uygulaması konusunda artan bir farkındalık vardır. Bu tekniğin ihmal edilmesinin nedeni, birçok proteinin genellikle yüksek oranda organik çözücü içeren mobil fazlarda çözünmez olarak kabul edilmesidir.

Bununla birlikte, birçok proteinin nispeten yüksek bir organik çözücü konsantrasyonunda (ters fazlı kromatografiden sonra) çözünür olduğunu ve bu nedenle doğrudan NPC’ye uygulanabileceğini belirtmek gerekir. Genel olarak NPC, heksan veya dimetil sülfoksit (örneğin membran proteinleri) gibi organik çözücüler içinde kısmen çözünebilen hidrofobik proteinler için kullanılabilir.

Tipik olarak, mobil fazın polaritesini artırmak için sulu mobil fazın organik çözücü içeriği azaltılır. Bir Lichrosorb diol fazında interferonların ayrılması bu prensibi göstermektedir.

Afinite Kromatografisi

Yüksek performanslı sıvı afinite kromatografisi (HPLAC), yakın zamanda tanıtılan bir HPLC formudur ve şu anda birkaç ticari sabit faz mevcuttur: Beckman Fast Affinity sabit faz, LKB ve Biorad’dan sabit fazlar ve Pierce High Performance Affinity sabit faz.

Kullanımları hakkında sadece birkaç rapor mevcuttur ve geçmişte en yakın durağan fazlar ayrı ayrı laboratuarlarda tescilli yöntemlerle hazırlanmıştır.

0,1 M piruvat varlığında laktat dehidrojenazın biyospesifik saflaştırılmasında HPLAC’ın kapasitesinin mükemmel bir kanıtı, hareketsizleştirilmiş adenozin monofosfat kullanılarak gösterilmiştir. Alkol dehidrojenazın ilk elüsyonu, NAD ve 0.1 pM pirazol kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Tersine, proteinler yüksek performanslı sabit fazlara (aktivite kaybı olmaksızın) bağlanabilir ve nükleotid kofaktörlerin hazırlanmasında ve çözülmesinde kullanılabilir. Her kofaktör için ayrılma sabitleri, çözelti çalışmalarından elde edilenlerle olumlu bir şekilde karşılaştırıldı, bu da koenzim bağlanma yerlerinin bozulmadığını gösterir.

Lökosit interferonun saflaştırılmasına yönelik bir araştırma, immünoglobulinlerin eklendiği silika veya agaroza dayalı sabit fazlar için karşılaştırılabilir özelliklerin elde edildiğini gösterdi.

Ligand ‘kanaması’, fiziksel ve kimyasal kuvvetlerden dolayı yumuşak jeller üzerinde afinite kromatografisinde büyük bir problem olmuştur, ancak silika veya polimer mikro kürelerin kullanımı ve gelişmiş birleştirme yöntemleri bu problemin üstesinden gelmelidir.

Boyut dışlama kromatografisi
Boyut dışlama kromatografisi Nedir
Jel Filtrasyon kromatografisi
Afinite kromatografisi
Jel filtrasyon kromatografisi kullanım alanları
Protein saflaştırma yöntemleri
Jel filtrasyon yöntemi
Kolon kromatografisi nedir

Boyut Dışlama Kromatografisi

Proteinler için özel olarak tasarlanmış olan boyut dışlama kromatografisi (SEC) desteklerinin yakın zamanda piyasaya sürülmesi, birçok biyokimyacıyı bunlardan yararlanmaya teşvik etmiştir; bununla birlikte, yaygın bir bulgu, birçok proteinin, durağan faz ile iyonik veya hidrofobik etkileşimler nedeniyle anormal şekilde davranmasıdır.

Şu anda, her bir proteinin ayrılması için ideal koşullar yalnızca deneysel olarak belirlenebilir, ancak genel yönergeler Bölüm 5’te bulunabilir. SEC’in saflaştırma ve tuzdan arındırmada kullanımının yanı sıra, en popüler uygulama, güçlü denatüre edici koşullar vardır.

SEC, bir numunenin saflığını değerlendirirken yüksek moleküler ağırlıklı agregaların tespiti için de kullanılabilir. SEC’de kullanılan mobil fazların, sabit faz ile kimyasal etkileşimi önlemek için, ancak aynı zamanda agregaları bozmayan katkı maddeleri içermesi gerekir, örn. iyonik olmayan deterjanlar, propilen glikol veya hafif kaotropik tuzlar. (Yüksek performanslı SEC uygulamalarının kapsamlı bir listesi Toya Soda Manufacturing)

Peptitler

HPLC, hem sentetik peptitlerin üretiminde hem de doğal olarak oluşan peptitlerin izolasyonunda uzun yıllardır peptitlerin analizi ve saflaştırılması için kullanılmıştır. Tekniğin kullanımına ilişkin kapsamlı bir literatür mevcuttur ve burada alıntılanan örnekler sadece ya son gelişmeleri ya da özel ve yeni uygulamaları açıklamaya hizmet etmektedir.

Ek olarak, peptitlerin ayrılmasında yeni iyon değişim sabit fazının uygulanması, üreticilerin sağladığı literatürde iyi bir şekilde belgelenmiştir. HPLC’nin saflaştırma, karakterizasyon (peptit haritalama), sıralama ve saflık değerlendirmesine uygulanması artık evrensel olarak kabul edilmektedir. Ek olarak, HPLC’ye dayalı başarılı tahliller geliştirilmiştir.

İyon değişim kromatografisi

Peptidlerde ters fazlı iyon çifti HPLC’nin yaygın kullanımı, iyon değişimli HPLC’nin bazı yönlerinden yararlanılmadığı anlamına gelir, örn. peptid haritalaması için. Bir epidermal faktör füzyon peptidinin triptik bir sindiriminden istenen iki bileşenin izokratik ayrımı, 50 mM asetat tamponu, pH 4.0 içinde aşamalı bir sodyum klorür gradyanı ile kombinasyon halinde bir katyon değişim sabit fazı kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Her türün saflığı% 90’dan fazladır. Ters faz ayrımlarının tersine, numune uçucu olmayan bir tamponda yıkanır ve bu da sonraki analizi zorlaştırır. Bununla birlikte, iyon değişim kromatografisi, denatürasyona bağlı olarak ters fazlı kromatografide bazen bulunan bazı artefaktları üretmez.

Ters faz kromatografisi

Peptitlerin ayrılması için ters fazlı HPLC’nin yaygın kullanımı, amino asit bileşimi bilinen bilinmeyen bir peptidin alıkonma süresinin tahmini için tasarlanan bir yöntemle sonuçlanmıştır.

Bir dizi peptidin tutulmasına ilişkin bir çalışmaya dayalı olarak, tutma katsayıları ayrı ayrı amino asitlere atfedilebilir ve bunlar da hidrofobiklikleriyle ilişkilendirilebilir. Bilinmeyen peptiddeki amino asitlerin tutma katsayılarının toplamı, elüsyon konumlarını tahmin etmek için kullanılabilir.

Tutma katsayılarının mutlak değerleri, mobil fazın bileşimine bağlıdır. Bununla birlikte, 10 kDa’dan büyük peptitler, muhtemelen organik çözücü ve pH’ın neden olduğu konformasyonel değişiklikler nedeniyle anormal davranabilir.

Trifloroasetik asit, iyi UV özellikleri ve birçok peptidi çözme kabiliyeti nedeniyle mobil fazda sıklıkla kullanılmaktadır. Diğer mobil fazlar, iyi bilinen tamponlardan türetilir, ancak çoğu belirli durumlarda kullanılamaz. Örneğin asetat tamponlar, 230 nm’nin altındaki yüksek hassasiyette kullanılamaz.

RPC’nin protein dizilemesine ek olarak kullanılması, bir proteinin enzimatik sindiriminden sonra peptit parçalarının izolasyonu için evrensel kabul kazanmıştır.

Her bir peptit, Edman reaktifi ve PTH-amino asitlerin ters faz kromatografisi ile elde edilen dizi ile reaksiyona sokularak işlenebilir.

RPC’nin diğer bir yaygın kullanımı, peptitlerin saflığının değerlendirilmesidir, ancak daha büyük peptitler için, tüm küçük safsızlıkların çözülmesini sağlamak için birden fazla tampon sisteminin kullanılması gerektiği açık hale gelmektedir.

UV tespiti bazı peptitler için tamamen tatmin edici değildir (çünkü tespit tirozin, triptofan ve fenil-alanin varlığına bağlıdır) ve bu nedenle kolon sonrası floresans tespit kullanılarak kapsamlı geliştirme gerçekleştirilmiştir.

The post Boyut Dışlama – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).