Yukarıda açıklanan nicel yöntemler, destekleyici jel ortamında gözle görülebilen çözünmeyen protein-antikor komplekslerinin oluşumuna dayanır. Çökelti sıvı bir ortamda düşük konsantrasyonlarda bir protein ve antikor tarafından oluşturulursa, süspansiyonda daha ince bir çökelti oluşur. Bu özellik, protein konsantrasyonunu ölçmek için kullanılabilir.

Bir çökeltinin mevcudiyeti, süspansiyondan geçen bir ışık huzmesinin geçişini engelleyecektir (bulanıklık). Alternatif olarak, süspansiyon tarafından saçılan ışık, gelen ışığa açılı olarak algılanabilir. Bu yönteme nefelometri denir.

Sabit bir antikor konsantrasyonunda immünopresipitat miktarı, antikorun tamamı antijene bağlanana kadar protein konsantrasyonuyla orantılı olarak artacaktır. Işık saçılımının ölçümü bu nedenle antikor fazlalığı koşullarında yapılmalıdır.

Bu, ya bir “son nokta” olarak ya da çökelti oluştukça saçılmadaki artışı ölçen bir hız analizcisi tarafından yapılır. Açıkça bu yaklaşım, radyal immünodifüzyon gibi daha da “düşük teknolojili” yöntemlerin aksine, özel aparatlar gerektirir, ancak bir dereceye kadar otomasyon ve büyük miktarda numune sunar.

Bazı laboratuvarlar, santrifüjleme sırasında reaktiflerin karıştırıldığı santrifüj analizörleri kullanır ve bu, test süresini azaltır. Sistemde olduğu gibi bu metodolojinin hassasiyet sınırı ve özellikle poliklonal olması gereken antiserum kalitesidir.

İyi bir sistemde, sınır yaklaşık 10 mg/l’dir, ancak bu, antikorlar küçük polistiren boncuklara bağlandığında “parçacıkla güçlendirilmiş” nefelometri kullanılarak yaklaşık iki büyüklük sırası ile iyileştirilebilir. İmmünoglobulin izotipleri ve alt sınıfları gibi klinik olarak önemli proteinlerin türbidimetri ve nefelometrisi için reaktifler ticari olarak mevcuttur.

Türbidimetri
Nefelometri nedir
Türbidimetrik yöntem Nedir
Türbidimetri çalışma prensibi
Türbidimetri Nedir
TÜRBİDİMETRİ ve Nefelometri tekniği
Türbidimetri cihazı
Türbidimetre

Enzim bağlantılı immünosorbent deneyleri

Enzim-bağlı bağışıklık tahlilleri (ELISA), aynı zamanda enzim-bağışıklık tahlilleri (EIA) olarak da adlandırılır, protein ölçümü için radyo-bağışıklık tahlillerinin yerini büyük ölçüde almış çok yönlü ve hassas bir prensibi temsil eder.

Proteinleri yaklaşık 1 mg/l konsantrasyona kadar ölçebilirler. İlgilenilen protein düşük konsantrasyonda mevcutsa kullanmak için uygun deneylerdir. Bu tahliller 96 oyuklu plastik plakalarda gerçekleştirilir ve reaktif kullanımı genellikle çok kanallı pipetler veya hatta otomatik pipetleme istasyonları aracılığıyla yapılır.

ELISA, otomasyona veya yarı otomasyona son derece uygundur ve bu nedenle, ölçülen protein yüksek konsantrasyonda olsa bile, numune seyreltmesini gerektirse bile, çok sayıda numune işleniyorsa bu teknik diğer basit yöntemlerden daha uygun olabilir, Radyal immünodifüzyon gibi.

Birçok laboratuvar kendi kurum içi ELISA sistemlerini oluşturur, ancak klinik olarak önemli serum proteinlerini, sitokinleri, mikrobiyal antijenleri (örn. Chlamydia trachomatis; Hepatit B virüs anti-virüslerini) ölçmek için testler de dahil olmak üzere çok çeşitli uygulamalar için ticari olarak mevcut kitler mevcuttur. gens), alerjenlere karşı IgE antikorları ve patojenlere karşı antikorlar.

NOT: (a) Dolaylı ELISA. Şekil, spesifik antikorların tespiti için bu tekniğin prensibini göstermektedir. (b) Bir numunedeki spesifik bir antijeni saptamak için doğrudan sandviç ELISA. (c) Bilinen bir antijene yönelik spesifik bir antikoru saptamak veya ölçmek için rekabetçi ELISA.

Yöntem, ölçülecek ‘hedef’ antikor olarak aynı antijeni tanıyan, tavşan veya koyun gibi bir hayvanda yetiştirilen (enzim-konjuge) bir antikora dayanır. Örnek, ELISA plakası üzerinde hareketsizleştirilmiş antijene bağlanmak için rekabet eden konjuge antikor ile karıştırılır.

(d) Bir proteini (antijeni) saptamak veya ölçmek için rekabetçi ELISA. Test edilen numune, ilgilenilen antijene (bu durumda bir tavşan antikoru) üretilen bir antikor ile inkübe edilir. Tavşan antikoru numunedeki hedef antijene bağlanır ve bu antikor moleküllerinin daha sonra antijen kaplı ELISA kuyusuna bağlanmasını önler.

Ön inkübasyonda antijene bağlanmamış herhangi bir tavşan antikoru, ELISA kuyusuna bağlanabilir ve tavşan IgG’sine (bu durumda koyun anti-tavşan IgG’si) enzim konjuge bir antikorun eklenmesiyle saptanır. Ölçülen enzim-substrat ürünü miktarı, orijinal numunedeki hedef protein miktarı ile ters orantılı olacaktır.

Farklı tahlil sistemleri ayrıntılı olarak farklılık gösterir, ancak temel ilkeler benzer kalır. En basit formlar, spesifik antikorları saptamak için “dolaylı ELISA” ve antijenleri saptamak için “doğrudan sandviç ELISA”dır.

Antikor tespiti için dolaylı ELISA (Şekil 45.8a), uygun bir hedef antijen (örn. bir patojenden protein) ile kaplanmış mikrotitre plaka kuyularına dayanır. Test edilen numuneler oyuklara uygulanır, ardından insan immünoglobulinine enzimle konjuge bir antikor uygulanır.

Enzim genellikle yaban turpu peroksidaz (HRP) veya alkalin fosfatazdır. Anti-insan immünoglobulinin seçimi, tüm izotiplerin (insan immünoglobulinleri IgG, IgA ve IgM’ye karşı oluşturulan antiserum kullanılarak) veya spesifik bir izotipin (örn., alerjenlere karşı IgE antikorları) saptanmasına olanak tanır.

Bağlanmamış konjuge antikoru uzaklaştırmak için daha fazla yıkamadan sonra, oyuklara uygun bir substrat eklenir. Uygun dalga boyunda (HRP için 450 nm; alkalin fosfataz için 492 nm) toplanan bir ELISA okuyucusu kullanılarak saptanan renkli bir ürün, orijinal numunede hedef antikoru gösterir. Bu testler nicel olabilir.

Antijenleri saptamak için doğrudan sandviç ELISA için, 96 oyuklu mikroplakaların (sekiz oyuklu şeritler olarak da elde edilebilir) oyukları, saptanan veya ölçülen proteine ​​karşı bir antikor ile kaplanır. Bunun bir çökeltici antikor olması gerekmez ve genellikle monoklonal antikorlar kullanılır.

Her kuyu, bir test numunesi veya bilinen konsantrasyonlarda bir dizi referans çözeltiden biri ile doldurulur. Kuyucuklar uygun bir süre (genellikle yaklaşık 1 saat) için inkübe edilir, ardından kuyu yüzeyinde antikor tarafından yakalanmayan materyali çıkarmak için kuyular yıkanır.

Kuyucuklar daha sonra ölçülmekte olan proteine ​​karşı başka bir antikorun bir solüsyonu ile doldurulur. Açıkça, birincil antikor bir monoklonal ise, aynı monoklonal antikor bu adımda etkili olmayabilir çünkü hedef protein, o antikor tarafından tanınan yalnızca bir antijenik belirleyiciye (epitop) sahip olabilir.

Bu, plaka kuyularında hareketsiz hale getirilmiş birincil antikor tarafından yakalandıktan sonra proteini tanıyacak ikinci bir antikoru tanımlamak için bazı deneylerin gerekli olduğu yerdir. Bu ikinci antikor enzime konjuge edilir.

The post Türbidimetri ve Nefelometri – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).