Hücre ve doku hazırlığı

RNA hedeflerinin amplifikasyonu için özel olarak tasarlanmış teknikler, RT IS-PCR ve RT PCR-ISH’dir. Genel olarak, hedefin başlangıç ​​kopyalarının artan sayısı nedeniyle, RNA hedeflerinin çoğaltılması DNA hedeflerinden daha kolaydır. Hücreler veya dokular vücuttan çıkarıldıktan sonra, RNA bozulması neredeyse anında başlar.

RNazlar çevrede her yerde bulunur; parmaklar, eldivenler ve tezgahlar birçok kaynaktan bazılarıdır. Fiksatif solüsyonlar, RNA’yı bozan spesifik RNazlar içerir ve tekrar RNazlar tarafından kontamine olan doku işleme, amplifiye edilebilecek hedef RNA miktarını en aza indirir.

Başlangıçta, RNase içermeyen bir çalışma ortamı oluşturulmalıdır. Doku bölümlerinde RNA’nın optimal korunması için, RNaz içermeyen solüsyonlarda hemen fiksasyon yapılmalıdır. Alkol, asetik asit:alkol ve otoklavlanmış DEPC (dietilpirokarbonat) ile işlenmiş su içerisinde hazırlanmış nötr tamponlu formaldehit fiksatifleri kullanılmalıdır. Nükleik asidin yeniden ortaya çıkarılmasına yönelik tüm protokoller, mümkün olduğunda, RNaz içermeyen koşullar kullanmalıdır.

Amplifikasyon metodolojisi ve kimyaları

Başlangıçta bir ters transkriptaz enzimi, genellikle Moloney fare lösemi virüsü (MMLV) RT kullanılarak bir cDNA şablonu oluşturulur, ardından yeni sentezlenen cDNA şablonunun amplifikasyonu yapılır. DNA PCR-ISH’de olduğu gibi bir amplifikasyon sonrası in situ hibridizasyon adımı kullanılabilir (RT PCR-ISH).

Bu teknikler iki aşamalı bir yaklaşım kullanır, yani ters transkripsiyon ve ardından amplifikasyon. Grubumuz, reaksiyonu bölme ihtiyacını ortadan kaldıran rTth DNA polimeraz enzimini kullanan tek adımlı bir metodoloji tanımladı. rTth polimeraz, hem ters transkriptaz hem de DNA polimeraz aktivitesine sahiptir.

Kostimülasyon nedir
Self reaktif ne demek
Periferik tolerans nedir
Sekonder immün yanıt antikoru nedir
Lökositoz tedavisi
Sağa kayma nedir
İmmün sistem hücreleri
İmmünolojik tolerans nedir

RNA in situ amplifikasyonu için kontroller

DNA in situ amplifikasyonunda olduğu gibi aynı kontroller kullanılır. Ters transkriptaz adımının atlanması, açık bir şekilde zayıf veya negatif bir sonuç verecektir. Paralel DNAaz sindirimi, özellikle optimizasyon aşamasında tüm hücre içi RNA deneylerinde gerçekleştirilmelidir.

Hücre içi PCR amplifikasyonunda karşılaşılan sorunlar

Birçok grup in situ PCR ile ilgili sorunlarla karşılaşmıştır. Önemli faktörler şunları içerir: başlangıç ​​materyalinin doğası, fiksasyon koşulları ve amplifiye edilecek hedefin konformasyonel yapısı. DNA in situ PCR, özellikle Taq DNA polimeraz varlığında meydana gelen parafine gömülü materyal ile özellikle zorluklarla doludur ve bu teknolojinin kullanılmaması gerektiği kanaatindeyiz.

PCR-ISH, özellikle bir “sıcak başlangıç” modifikasyonu kullanılıyorsa veya alternatif olarak birden fazla primer çifti kullanılıyorsa daha spesifik görünmektedir. Genel olarak PCR-ISH protokolleri daha duyarlıdır, ancak çözelti fazlı PCR’nin aksine, yalnızca görünür doğrusal amplifikasyon ile daha az verimlidir.

Amplifikasyon derecesini değerlendirmek zordur. Nuovo et al. sadece 10-30 katlık bir artış tahmin eden Embretson ve meslektaşlarının (1993) aksine, üründe 200-300 kat artış bildirdiler. Deneyimlerimiz ikinci rakamı destekleme eğiliminde olacaktır.

DNA IS-PCR ile ilgili en büyük sınırlama, daha önce bahsedildiği gibi, nükleotidlerin hasarlı DNA’ya Taq DNA polimeraz tarafından spesifik olmayan dahil edilmesidir. Bu döngüye ve DNA polimeraza bağlıdır ve primerlerin yokluğunda ve/veya bir “sıcak başlangıç” modifikasyonu ile ortaya çıkabilir.

Bu nedenle, yanlış sinyal üretme riskinden dolayı DNA in situ PCR’nin rutin kullanımı henüz mümkün değildir. Gosden et al. (1991), daha önce DNA in situ PCR sırasında sahte katılımı ortadan kaldırmak için kromozomal çalışmada iplik kopması birleştirmenin kullanıldığını bildirmişti. Di-deoksi blokajı ile ön işlemin de spesifik olmayan birleşmeyi ortadan kaldırdığı belgelenmiştir, ancak bu her zaman başarılı değildir.

Grubumuz, dsDNA’nın yüksek sıcaklıklarda denatüre olduğu “süper denatürasyon” dizisini kullandı. DNA daha sonra uzun bir süre (5-10 dakika) denatüre bir durumda tutulur, ancak yine bu tutarsız sonuçlar doğurmuştur.

Reaktif Sekestrasyonu

Başarılı in situ amplifikasyon elde edilecekse (genellikle 2-5 kat mertebesinde) artan reaktif konsantrasyonları gerekir. Bu, reaktif sekestrasyonundan kaynaklanır, çünkü reaktifler slaytlara veya kullanılan kaplama malzemelerine yapışır. Ek olarak, reaktifler dokularda kalan fiksatif kalıntılarla da karışabilir. Slaytların %0.1-1 bovin serum albümini (BSA) ile ön işleme tabi tutulması, reaktif konsantrasyonunda bir azalmaya izin verir ve bu, bu sekestrasyonu bloke ederek işlev görebilir.

Amplikon difüzyonu ve geri difüzyonu

Hücre içi PCR analizlerinde, geçirgenleştirme ve/veya hücre kesilmesinin bir sonucu olarak oluşabilen sentez bölgesinden ürün difüzyonu ile yaygın olarak karşılaşılır. Bir yaklaşım, döngü sayısını azaltmaktır. Sıklıkla kullanılan diğer bir strateji, slaytları etanol veya paraformaldehit içinde sonradan sabitlemektir, bu da ürünün lokalizasyonunu korumaya yardımcı olur.

Alternatif yaklaşımlar arasında doku kesitinin agaroz ile kaplanması ve/veya biotin ile sübstitüe edilmiş nükleotidlerin (in situ PCR’ye benzer) dahil edilmesi yer alır. Bu son değişiklik, yayılma olasılığı daha düşük olan daha hacimli ürünlerin üretilmesini teşvik eder.

Yamalı amplifikasyon/eksik amplifikasyon

Yamalı amplifikasyonla yaygın olarak karşılaşılır, hücrelerin %30-80’i herhangi bir zamanda hedef boyamayı içeren hedef diziyi içerir. Bunun, hücre geçirgenliğindeki varyasyonlarla birlikte tek tip olmayan sindirim, DNA-histon protein çapraz bağlarının tamamen ayrılmaması ve hücre kesilmesi dahil olmak üzere birçok nedeni vardır.

Bu ikinci faktör, hücre ‘yarı kürelerinin’ oluşturulduğu mikrotom kesitinin kaçınılmaz bir sonucudur. Sonuç olarak, nükleer içerikler kesilir ve iki olasılık ortaya çıkar: (a) istenen hedef dizi mevcut olmayabilir; (b) hedef dizi mevcut olabilir ancak ürün dağılmış olabilir.

Hücre içi PCR tabanlı tahlillerle gelecekteki çalışmalar

Hücre içi TaqMan PCR’deki son gelişmeler, araştırmacıların hücre ve doku numuneleri içindeki transkriptleri doğrudan nicelleştirmesine olanak tanır. İki renkli tespit sistemlerini kullanma yeteneği, bir temizlik geninin ve bir hedef genin eşzamanlı tespitine izin verir.

Hücre içi TaqMan PCR, belirli sayıda döngüden sonra floresan söndürmenin görülebildiği klasik TaqMan prob kinetiğini gösterir. Bu, sitoplazmanın/çekirdeğin hacim sınırlı alanından kaynaklanır ve sondanın hidrolizini takiben ‘serbest halde’ molar fazlalıkta söndürücü ve raportör dizilerinin yakınlığı ile ortaya çıkar.

Hücre içi TaqMan PCR’nin keşfi teorik olarak doğrudan nicel analiz için TaqMan dizilerinin tanıtılmasını mümkün kılmalıdır. Bu, geleneksel cDNA ve SNP hibridizasyon dizi platformlarına göre büyük bir avantaj sunacak ve ilk kez aynı anda birden fazla genetik lokusun gen nicelleştirilmesine izin verecekti. Tablo 52.1, hücresel patolojide hücre içi PCR analizlerinin mevcut kullanımını listeler.

The post Reaktif Sekestrasyonu – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).