Kinetik veya “gerçek zamanlı” PCR, giderek geleneksel PCR’nin yerini alan bir yöntemdir. Bu, primerlerin, probların veya amplikonun florojenik moleküllerle etiketlenmesiyle mümkün hale gelmiştir. Spesifik bir ürün biriktikçe, reaksiyondan yayılan artan floresan birikimi ortaya çıkarır.

Geleneksel PCR’nin aksine, reaksiyon karışımının manipülasyonu yoluyla ürünün amplifikasyon sonrası tespiti gerekli değildir. Ürün, kapalı bir numune tüpü içinde tespit edilir.

Testlerin amplikon türevi çapraz kontaminasyon olasılığı böylelikle büyük ölçüde azaltılır ve amplifiye nükleik asit birikimi gerçekleşirken tespit edildikçe test çok daha hızlı tamamlanır.

Ek olarak, ürünün doğru miktarının belirlenmesinin mümkün olduğu konsantrasyon aralığı, daha geleneksel rekabetçi PCR formatlarında elde edilebilecek olandan çok daha fazladır.

Gerçek zamanlı PCR’de floresan saptamayı sağlamak için çeşitli yöntemler mevcuttur. En basit haliyle, reaksiyon karışımına etidyum bromür veya SYBR1 yeşil 1 gibi bileşikler eklenir. Bunlar dsDNA’ya bağlanır ve uygun bir dalga boyundaki ışıkla uyarıldığında floresanlaşır.

Yapay primer-primer dimerlerinin oluşumu ve ilgisiz hedef olmayan DNA’nın spesifik olmayan amplifikasyonu yanlış pozitif floresan sinyaller üretebileceğinden, bu yaklaşım ideal değildir. Bu sorun, nihai ürünün ısıtılması ve ürünlerin ayrışma sıcaklığının ölçülmesiyle çözülebilir. Primer dimerleri, spesifik PCR ürünü için olandan daha düşük bir sıcaklıkta ayrışacaktır.

Gerçek zamanlı PCR’nin özgüllüğü, bir floresan prob ile etiketlenmiş etiketli oligonükleotid “probları” kullanılarak büyük ölçüde geliştirilir. Probu etiketlemek ve saptamak için çeşitli yöntemler mümkündür. En popüler olanlardan ikisi hibrid prob veya 50 endonükleaz (Taqman1 olarak da bilinir) prob yöntemleridir.

Hibridizasyon probları iki prob oligonükleotidi gerektirir; biri 30 verici florofor ile etiketlenir ve ikincisi uygun bir alıcı florofor ile etiketlenir.

real-time pcr ve pcr farkı
real-time pcr pdf
Real time PCR COVID-19 test
real-time pcr aşamaları
real-time pcr protokolü
Real time PCR Nedir
real-time pcr pdf türkçe
Real-time PCR sonuç değerlendirme

Oligonükleotitler, birbirine bitişik hedef nükleik aside bağlanır ve florofor uygun bir dalga boyunda ışıkla etkinleştirildiğinde, floresan rezonans enerji transferi (FRET) olarak bilinen bir işlemle enerjiyi bitişik 50 alıcıya aktarır. daha sonra farklı dalga boyunda ışık yayan florofordür.

Bu emisyonun tespiti, bitişik oligonükleotid problarının hedef nükleik asidine spesifik bağlanmasını işaret eder. Bu ikili probların kullanımına bir alternatif, tek bir oligonükleotid kullanımı ve Taq polimerazın 50-30 endonükleaz olarak işlev görme yeteneğidir.

Bir sonda oligonükleotidinin 50 ucuna bir florofor eklenir ve genellikle sonda oligonükleotidin 30 ucuna ikinci bir florofor eklenir. Normal koşullar altında bir floroforun uyarılması, diğer florofora FRET floresans transferine yol açar.

Bu, genellikle tespit edilemeyen farklı bir dalga boyunda ışık yayılmasına yol açar. Floresansın söndürüldüğü söyleniyor. Oligonkleotid, hedef nükleik asidi ile melezlendiğinde, floroforlar hidroliz yoluyla salınır ve flüoresans artık söndürülmez.

Peptid nükleik asit probları (‘Light-upTM’ probları), firkete oligonükleotid probları (‘moleküler işaretçiler’) ve kendi kendine floresan amplikonlar (ör. ‘SunriseTM’ primerler veya ‘ScorpionTM’ primerler) dahil olmak üzere bunlara çok sayıda alternatif mevcuttur.

Artık gerçek zamanlı PCR’da kullanılabilecek çok çeşitli araçlar bulunmaktadır. Bu enstrümanların en hızlılarından biri “Lightcycler1” dir. Reaksiyon kabı olarak plastik oturtulmuş bir cam kapiler kullanılır.

Kapiler, reaktanların çok hızlı bir şekilde ısıtılmasına ve soğutulmasına izin verir ve ayrıca reaksiyon kabı içindeki flüoresansın doğrudan tespitine izin verir. Isıtma ve soğutma, bir termal eleman ve bir fan kullanılarak gerçekleştirilir. Kılcal damarlar mavi yayan bir lazer diyotunun önünde döndürülür ve kılcal damar içindeki floresan, her biri aktivasyon için farklı dalga boyu filtrelerine sahip üç foto algılama diyotu aracılığıyla izlenir.

Bu sistemde elde edilen hızlı ısıtma ve soğutma (20 C / saniye), 40 çevrimlik tipik bir termal döngü profilinin 20 dakikada tamamlanabileceği anlamına gelir.

Otomasyon ve PCR

Geleneksel PCR gerçekleştirmek için gereken yüksek seviyeli teknik beceri, ticari test kitlerinin artan bulunabilirliği ile bir dereceye kadar ele alınmıştır. Nükleik asitlerin ekstraksiyonu için güvenilir, yüksek verimli yöntemlere duyulan ihtiyaç önemli bir engel olmuştur.

Robotikteki son gelişmeler ve reaktiflerin standardizasyonu, şimdi numune hazırlama ve test kurulumunu otomatikleştirebilen çeşitli platformların geliştirilmesine yol açmıştır. Bu yöntemler, PCR performansı için gerekli teknik beceriyi azaltır, test tekrarlanabilirliğini geliştirir ve yüksek verimli testlere elverişlidir, NAAT testinin daha geniş bir klinik laboratuar yelpazesine ve daha geniş bir viral patojen yelpazesine uygulanmasına yardımcı olur.

Transkripsiyon Aracılı Amplifikasyon

Hedef büyütme için bir dizi alternatif yöntem geliştirilmiştir. Transkripsiyon aracılı amplifikasyon (TMA) bir örnektir. Viriyondan nükleik asidi serbest bırakmak ve stabilize etmek için tescilli bir ekstraksiyon tekniğinin ardından, test numunesi, hedef nükleik asidi denatüre etmek için kısa bir süre 95 ° C’ye ısıtılır. Nükleik asidi amplifiye etmek için, RNA polimeraz için bir promoter sekansının eklendiği bir oligonükleotid, spesifik olarak hedefe bağlanır.

Hedef nükleik asit RNA ise, bir izotermal reaksiyonda, bir ters transkriptaz enzimi (RT), promoter-primerin 30 ucundan uzatma yoluyla RNA şablonunun bir DNA kopyasını oluşturur. RNA – DNA dupleksindeki RNA daha sonra ters transkriptazın RNAaz etkisi ile bozulur.

İkinci bir oligonükleotid şimdi cDNA kopyasına bağlanır ve yeni bir DNA ipliği RT ile sentezlenir. Eklenmiş RNA promotörlü DNA dupleksi, RNA polimeraz tarafından transkripsiyon için bir şablon görevi görür.

Yeni sentezlenen RNA kopyaları aynı zamanda TMA sürecine yeniden giren yeni şablonlar olarak işlev görür ve yeni bir replikasyon turu üreterek RNA amplikonlarında üstel bir artışa yol açar. Hedef RNA amplikonlarına spesifik olarak bağlanan akridinyum ester etiketli bir DNA probunun eklenmesi, bağlanmamış probun kimyasal denatürasyonundan sonra, kemilüminesans kullanılarak ürünün saptanmasına izin verir.

Nükleik Asit Dizisine Dayalı Amplifikasyon

Nükleik asit sekansına dayalı amplifikasyon (NASBA) yüzeysel olarak TMA’ya oldukça benzerdir; ancak, TMA bir izotermal amplifikasyonda iki enzim kullanırken, NASBA üç enzim kullanır. Tescilli bir silika bazlı nükleik asit ekstraksiyon yöntemi kullanılarak nükleik asidin ekstraksiyonundan sonra, bağlı bir T7 RNA polimeraz promoterine sahip bir oligonükleotid primeri, 30 ila 50 yönde hareket eden RT’nin etkisiyle uzatılır.

The post Gerçek Zamanlı PCR – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).