Karşı akım elektroforezi prensipte immünodifüzyona benzer, ancak antijen ve antikor jel içinde birbirlerine doğru elektroforezlenir. Difüzyon yerine elektroforez kullanılması, sonuçların daha hızlı elde edilmesi anlamına gelir.

Karşı akım immünoelektroforezinin hızlı bir başlangıç ​​tarama yöntemi olarak (örn. ekstrakte edilebilir nükleer antijenlere karşı antikorları saptamak için) kullanılması ve Ouchterlony immünodifüzyon gibi diğer yöntemlerle doğrulanan pozitif sonuçların kullanılması önerilmiştir.

İmmünoelektroforez

Kalitatif immünoelektroforez (orijinal olarak Grabar ve Williams tarafından tarif edilmiştir) selüloz asetat, agar veya agarozda elektroforez ile başlar. Elektroforez yoluna bitişik olarak membran veya jelde bir oluk kesilir.

Elektroforezi takiben, oluğa antiserum yerleştirilir ve membran/jel birkaç saat nemli bir atmosferde inkübe edilir. Bu süre boyunca, elektroforetik olarak ayrılmış proteinler ve oluktan antikor molekülleri, destek ortamı boyunca yayılır.

Ayrılan proteinlere karşı antikorlar varsa, jelde “eşdeğer” konsantrasyonlarda çözünmeyen bir immüno-çökelti oluşur. Bu çökeltiler genellikle boyanmamış “ıslak” jelde görülebilir ancak jel yıkandıktan, sabitlendikten ve lekelendikten sonra hassasiyet artabilir.

Tam seruma yükseltilmiş bir antiserum, antiserumda antikorların bulunduğu mevcut tüm proteinleri temsil eden çökelti yaylarını ortaya çıkarır. Bir çökelti arkının olmaması (bir referans numuneyle karşılaştırıldığında) bir protein eksikliğini gösterir. Monoklonal paraprotein, anormal şekilli veya belirgin çökeltiler nedeniyle de belirgin olacaktır.

Bir paraprotein gibi spesifik bir proteinin varlığı veya kimliği, oluğa spesifik bir antiserum (örneğin insan IgG, IgA veya IgM ağır zincirleri veya / veya hafif zincirleri için spesifik antiserum) koyarak doğrulanabilir.

RADYAL katalog
Radyal Havlupan
Radyal bayileri
Radyal Konak Radyatör
Radyal Villa Radyatör
Radyal Radyatör yorumları
Radyal Residence
Radyal Yalı Modeli

NOT: (a) Kalitatif immünoelektroforez ilkesini gösteren diyagram. Hastanın numunesi, jelin içine açılmış bir kuyuya yerleştirilir ve proteinler elektroforez ile ayrılır. Elektroforezden sonra, antiserum ayrılan proteinlere paralel uzanan bir oluğa konur. Jel, ayrılan proteinlerin ve antiserum moleküllerinin birbirine yayılmasına izin vermek için nemli bir atmosferde bırakılır.

Antikor moleküllerinin bulunduğu proteinlerin varlığı, yay şeklinde bir çökelti ile sonuçlanır. (b) İki serum örneğinin immünoelektroforezi. İki numune uygulama kuyusu, insan serum proteinlerine karşı yükseltilmiş koyun antiserumunu içeren bir oluk ile ayrılmış, jelin merkezindedir.

Elektroforez, katot sağda olacak şekilde gerçekleştirildi. Alttaki serumdaki immünopresipitat arkları normal bir patern gösterir; IgG, IgA ve IgM için olanlar etiketlenmiştir. Bu immüno-çökeltilerin üst örnekte bulunmadığına dikkat edin, bu hastanın üç immünoglobulinin hepsinde eksik olduğunu gösterir.

NOT: Tek radyal immünodifüzyon. Bu örnek, içinde insan IgG2’sine karşı bir antiserumun çözüldüğü bir agaroz jeli göstermektedir. Jel içine açılan kuyucuklara insan serumu örnekleri yerleştirildi. Plaka, numunelerdeki proteinlerin jel boyunca yayılmasını sağlamak için inkübe edildi.

IgG2 molekülleri, IgG2’ye karşı antikorlarla bağlandı, bu da görünür çözünmeyen çökelti halkaları ile sonuçlandı. Bir çökelti halkasının alanı, numunedeki IgG2 konsantrasyonu ile orantılıdır. Bazı örneklerde IgG2 eksikliğini gösteren halkaların bulunmadığına dikkat edin.

NOT: Karşı akım elektroforezi. Bu örnek, otoantikorları saptamak için tasarlanmış ticari bir kittir. Soldaki (katot) kare kesitlerde hedef antijen ve anotta uygulanan hasta serumu (bu resmin sağ tarafı).

Bir elektrik akımının etkisi altında antijen ve hastanın immünoglobulin molekülleri birbirine doğru göç eder. Bir protein boyası ile boyanmış bir immüno-çökelti, antijene karşı otoantikorların varlığını gösterir.

Nicel Yöntemler

Radyal immünodifüzyon

Bu yöntem aynı zamanda ‘tek radyal immün difüzyon’ veya ‘mancini yöntemi’ olarak da bilinir. Uygun bir tampon içinde eritilmiş agar veya agaroz yaklaşık 55°C’ye soğutulur ve ölçülecek proteine ​​özel çökeltici antiserum uygun konsantrasyona eklenir.

Antiserum içeren jel, bir cam veya plastik plaka veya tepsi üzerine dökülür ve soğumaya bırakılır, bunun üzerine jel katılaşır. Kuyucuklar jel içinde kesilir ve bunların her biri birkaç mikrolitre test serumu ile doldurulur. Bir dizi kuyunun her biri, test edilecek proteinin bilinen konsantrasyonlarını içeren referans serum (veya referans solüsyon) ile doldurulur.

Plaka, numunelerdeki proteinlerin ve referans çözeltilerin çevredeki antiserum içeren jele yayılmasına izin vermek için nemli bir atmosferde bırakılır. Test edilen protein molekülleri jele difüze olurken, antiserum molekülleri ile çökeltiler oluştururlar.

Bu çökeltiler, antijen (protein) konsantrasyonu antiserumunkinden fazla kaldığı sürece kısmen çözünür. Bu nedenle, bazı protein molekülleri, antijen konsantrasyonu antikorların konsantrasyonuna “eşdeğer” olana kadar numune kuyusundan radyal olarak yayılmaya devam eder.

Bu noktada numune kuyusu çevresinde çözünmeyen bir çökelti halkası oluşur. Halkanın alanı (ve dolayısıyla çapı), test numunesindeki protein konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. Gerçekten de, jeldeki antiserum konsantrasyonunun ve numune protein konsantrasyonlarının uygun sınırlar içinde olması ve difüzyon işleminin tamamlanmasına izin verilmesi şartıyla, immüno-çökelti halka alanı protein konsantrasyonu ile doğrusal orantılıdır.

Bu, test sisteminin deney yoluyla titre edilmesini gerektirir. Bu ayrıca, difüzyon ve çökelti oluşumunun tamamlanması için plakaların önemli bir süre (belki birkaç gün) bırakılması gerekebileceği anlamına gelir.

Bu kısıtlamalar bazı rutin laboratuvarlar için uygunsuz ve çok yavaş olabilir, ancak immünoglobulin izotipleri, alt sınıfları ve hafif zincirleri dahil klinik olarak ilgili proteinlerin ölçümü için ticari radyal immünodifüzyon plakaları artık mevcuttur.

Bu ticari plakalar, difüzyon tamamlanmadan önce (Fahey ve McKelvey yöntemi) doğru ve kesin sonuçların elde edildiği ve sadece birkaç saat içinde sonuç veren hassas toleranslar dahilinde üretilir.

Aslında, antiserum konsantrasyonları o kadar doğru bir şekilde dahil edilmiştir ki, küçük ve genellikle alakasız bir doğruluk kaybıyla, standart referans solüsyonları kullanılmadan halka çaplarından kit ile sağlanan standart referans eğrilerine kadar protein konsantrasyonları enterpole edilebilir.

Radyal difüzyon testinin duyarlılık sınırı büyük ölçüde antiserumun kalitesine bağlı olacaktır, ancak genellikle yaklaşık 5 mg/l civarındadır. Ticari olarak geliştirilmiş bazı plakalar, proteinleri 0,2 mg/l’ye kadar düşürebilir.

The post Radyal – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).