Gaz kromatografisi ve ardından kütle spektrometrisi çok hassas bir tekniktir ve çok doğru yapısal bilgiler verebilir, ancak maalesef numune hazırlama son derece zaman alıcıdır ve açıkça gereken ekipman çok pahalıdır.

Son yıllarda RIA’daki gelişmeler, tahlil tekniklerinin hem duyarlılığında hem de özgüllüğünde büyük gelişmeler sağlamıştır ve bu muhtemelen bu alanda en sık kullanılan tahlil yöntemidir; bununla birlikte, belirli bir RIA her seferinde yalnızca bir bileşiğin miktarını belirlemek için kullanılabilir, böylece tam bir prostaglandin ve lökotrien profili gerekiyorsa, teknik aşırı derecede zaman alıcıdır.

Bu tekniklerin dezavantajlarından dolayı, TLC ve HPLC metodolojileri geliştirilmiştir ve son araştırmalar, TLC’ye göre sayısız avantajı nedeniyle HPLC’ye odaklanma eğilimindedir. Kantitatif tespitler için RIA veya yapısal analizler için kütle spektrometresi kullanılmadan önce HPLC’nin sıklıkla numune hazırlama için kullanıldığı da vurgulanmalıdır.

Prostaglandinlerin HPLC’si

Normal faz, ters faz ve gümüş iyon yüklü katyon değişim kromatografisi dahil olmak üzere prostaglandinlerin HPLC’si için çeşitli kromatografik modlar kullanılmıştır.

Sonraki saptamayı kolaylaştırmak için önceden türetme prosedürleri ile ve olmadan, normal faz durağan fazları kullanan bir dizi HPLC ayrımı rapor edilmiştir.

Kullanılan en popüler sabit faz, hem izokratik hem de gradyan modları olan bir dizi farklı mobil faz ile kombinasyon halinde silikadır. Örneğin, kaydedilen en eski prostaglandin ayrımlarından biri, 15-epi-PGF2’yi PGF’den ayırmak için bir mobil etil asetat-asetik asit fazı kullandı.

Diğer çalışanlar, PGB’yi çözmek için mobil bir kloroform-etil asetat-formik asit fazı kullandılar. Prostaglandinlerin 4-bromo-7-metoksikumarin ile önceden türetilmesinin, bir mobil faz kullanılarak PGF,  6-keto-PGF1, tromboksan ve (TxB,), PGE ve PGD’nin çözünmesine ve miktarının belirlenmesine izin verdiği bildirilmiştir. 

Normal bir faz ayrımında üretilen tipik bir kromatogram, gösterilmektedir. kloroformun bir başlangıç ​​mobil fazı ve kloroform-metanol-asetik asidin bir son mobil fazı ile bir gradyan ayırmanın kullanılmıştır.

Bu kromatogram, her ikisi de önemli prostanoid türevleri olan, ko-kromatografinin genellikle özellikle TxB ve 6-keto-PGF ile bir problem olduğu prostaglandinlerin normal faz HPLC’si ile ilişkili ana sınırlamaları gösterir. Bu seçicilik problemlerinden dolayı normal faz kromatografisinin yerini büyük ölçüde ters faz modu almıştır.

Prostaglandin hormonu
Prostaglandin ilaçlar
Kadınlarda prostaglandin
Prostaglandin içeren besinler
Prostaglandin hangi besinlerde bulunur
Kadınlarda prostaglandin nedir
Prostaglandin E2 nedir
Prostaglandin yüksekliği

Ters faz, prostaglandinlerin ayrılması için kullanılan en popüler kromatografik moddur. En yaygın kullanılan sabit ve hareketli fazlar, asetonitrilin mobil fazı ve düşük konsantrasyonlarda asetik veya fosforik asit eklenmesiyle pH 2-3’e ayarlanmış su ile kombinasyon halinde ODS’dir.

Ters faz modunda araşidonik asitten türetilen metabolitlerin tam ayrılmasını sağlamak için, asetonitril konsantrasyonunun% 20-30’dan% 95-100’e yükseltildiği bir gradyan sistemi kullanmak gerekir.

Genel olarak, asetonitril, organik modifiye edici olarak kullanılır, çünkü metanole göre birkaç farklı avantaj sağlar; ilk olarak, asetonitril, prostaglandinlerin spektrofotometrik tespiti için yaygın olarak kullanılan bir dalga boyu olan 192 nm’de nispeten yüksek bir optik şeffaflığa sahipken, metanol yaklaşık 210 nm’lik bir optik kesme dalga boyuna sahiptir.

İkinci olarak, fosfat tuzları, asetonitril içinde metanolden daha fazla çözünürdür, böylece mobil fazda daha yüksek tuz konsantrasyonlarının kullanımına izin verir. Son olarak, prostasiklin, metanol varlığında izomer oluşumuna girme eğilimindedir.

Ana prostaglandin türlerinin izokratik ters faz ayrılmasına bir örnek, Şekil 11.5.2’de gösterilmektedir. TxB ve PGF’nin taban çizgisi ayrımının sağlanmadığı ve PGE ve PGD’nin çözülmediği açıktır. Bununla birlikte, hafif bir asetonitril gradyanı eklenerek, bir taban çizgisi ayrımı elde edilebilir.

Gradyan koşulları altında bile, TxB’nin pik genişlemesinin, genellikle ayırmalarda kullanılan asidik mobil faz koşulları altında ODS durağan fazlarında meydana geldiği fark edilir. TxB’nin geniş asimetrik zirvelerinin nedeninin, asidik pH’ta TxB’nin yapısındaki açık ve kapalı bir yarı asetal halka arasında bir dengenin varlığı olduğu düşünülmektedir.

İki izomerik form arasındaki denge, mobil fazın nötr bir pH değerine değiştirilmesiyle kaydırılabilir, ancak bu, silika sabit fazlarda pik tortulaşmasına neden olabilir.

Bu soruna bir çözüm, asetik asit ile pH 7.5’e ayarlanmış damıtılmış su içinde% 218 ila% 100 asetonitril artı% 1.2 (v / v) trietilaminden oluşan bir mobil faz gradyanı ile birlikte alternatif bir silika bazlı olmayan sabit faz kullanmaktır. Bu koşullar kullanılarak, 6-keto-PGF ,,, PGF, ve PGE’den iyi bir ayrılma ile birlikte TxB’nin elüsyonu için keskin bir tepe elde edildi.

Prostaglandinlerin ayrılmasını arttırmak için gümüş iyonlarının kullanımı ilk olarak TLC’de açıklanmıştır; burada gümüş nitrat ile emprenye edilmiş silika 1, 2 ve 3 serilerinin prostaglandinlerini çözmek için kullanılmıştır. Prostaglandinlerin ayrılması için Argantasyon HPLC’si ilk olarak 1976’da PGE örneklerinde 5-trun-PGF2 izlerinin belirlenmesi için açıklanmıştır.

Tartışmada, fenilsülfonik asit türevlerini oluşturmak için muamele edilmiş HPLC silika katyon değişim sabit fazları, 1 M gümüş nitrat ile yıkanarak normal Naf formlarından gerekli Ag ‘formuna dönüştürülür.

Argentasyon kromatografisinde tutulmanın iki ayrı ancak eşzamanlı mekanizma ile meydana geldiği düşünülmektedir: birincisi, sabit fazlı gümüş iyonlarının numune moleküllerinin olefinik çift bağları ile etkileşimi yoluyla, böylece alıkoymayı numunenin doymamışlık derecesine bağımlı hale getirerek ve ikinci olarak durağan fazın polar gruplarının örnek molekül üzerindeki polar gruplarla etkileşimi söz konusudur.

Argantasyon HPLC’de kullanılan en popüler mobil fazlar, kromatografik tutmayı en iyi şekilde ayarlamak için değişen oranlarda asetonitril ve / veya metanol içeren kloroform (% 80-90) ve asetik asit (% 0.5) karışımlarıdır.

Metanolün hareketli faza eklenmesinin, durağan fazda polar gruplarla etkileşimleri azalttığı, asetonitrilin ise durağan faza bağlı gümüş iyonları ile doğrudan etkileşim yoluyla tutulmayı azalttığı ve böylece olefinik doymamış bağlarla etkileşimleri azalttığı düşünülmektedir.

The post Prostaglandinler – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).