Ters fazlı HPLC, adenozinin dört monofosfatının, yani 2′-, 3′-, 5′- ve 2 ‘, 3′ fosfatların ayrılması için başarıyla kullanılmıştır. Yöntem, 2′-deoksiadenosin, 2′-deoksitimidin ve 3’-deoksiguanozin nükleotidlerinin çözünürlüğü için eşit derecede faydalıdır.

Mobil fazda eklenen organik çözücü konsantrasyonu, muhtemelen sabit fazdaki alanlar için rekabet ederek, retenasyonu azaltan yüksek konsantrasyonlu ayırmaları güçlü bir şekilde etkiledi. Nükleotidlerin elüsyon sırası genellikle bileşiklerin hidrofobikliği ile ilişkilidir.

Ters Fazlı İyon Çifti HPLC

Ters faz modu, çoğu nükleotit tarafından yaygın olarak kullanılan pH değerlerinde taşınan negatif yük nedeniyle nükleotitlerin ayrılması için bariz sınırlamalara sahiptir; bu, hem zayıf tutmaya hem de çözünürlük eksikliğine neden olabilir.

Mobil faza bir iyon eşleştirme reaktifinin eklenmesi, bu problemlerin üstesinden gelmek için kullanılabilir. Böylece, iyon eşleştirme reaktifi olarak tetra-n-butilamonyum hidrojen sülfat içeren bir gradyan mobil faz kullanılarak on iki nükleotid fosfat çözüldü.

Bakteriyel hücrelerden nükleotidlerin ayrılmasında iyon değişimi, ters faz ve ters faz iyon çifti kromatografisinin bir karşılaştırması, ikinci yöntemin analitik ayırmalar için tercih edilebilir olduğu sonucuna varmıştır. Elde edilen çözünürlük, büyüme koşullarının hücre içi nükleotid seviyeleri üzerindeki etkisinin ayrıntılı analizine izin verdi.

Ters faz iyon çifti kromatografisi kullanılarak nükleotidlerin ayrılması için optimum mobil faz koşullarının, karşı iyon olarak tetrabutilamonyum fosfat (TBAP) içeren bir fosfat tamponu olduğu bulunmuştur.

50 mM ile 120 mM arasındaki fosfat konsantrasyonları en iyi çözünürlüğü verirken, 0.5 mM ile 2.0 mM arasındaki konsantrasyonlarda TBAP ilavesi çözünürlük ve tutma süresini önemli ölçüde artırdı. 2.0 mM’den yüksek konsantrasyonlar, çözünürlüğü iyileştirmeden tutmayı artırdı.

Bir organik çözücünün (özellikle asetonitril) eklenmesi, çözünürlük üzerinde çok az etkiye sahipken tutmayı azaltmak için kullanılabilir. Mobil fazın pH değerinin varyasyonları, yakından ilişkili nükleotid çiftleri arasındaki seçiciliği modifiye etmek için kullanılabilir.

Polinükleotit zinciri nedir
Oligonükleotid primer nedir
Oligonükleotid Nedir
Pcr nedir
PCR aşamaları
Polinükleotit nedir
Dntp Nedir
polimeraz zincir reaksiyonu (pcr nedir)

Normal Fazlı HPLC

Doğal nükleotidler, normal faz modunda kromatografiye izin vermeyecek kadar kutupsaldır, ancak DNA’nın kimyasal sentezi için öncül olarak kullanılan kimyasal olarak değiştirilmiş nükleotidler çok daha az kutupsaldır.

Bu sentetik moleküllerdeki tüm reaktif bölgeler kimyasal olarak bloke edilir ve nötr, lipofilik bileşiklerdir; bu nedenle, ayrılmaları için tercih edilen analitik ve hazırlayıcı mod, normal faz silika adsorpsiyon kromatografisidir.

Oligo ve Polinükleotidler

Hem doğal hem de sentetik genetik materyalin saflaştırılması, rekombinant DNA araştırmalarında temel öneme sahiptir. Örneğin, ilk enzimatik sindirim ve müteakip saflaştırma ile DNA sınırlama fragmanlarının oluşturulması, sekans analizinin veya genetik rekombinasyonun ortadan kaldırılmasına izin verir.

Ek olarak, spesifik haberci RNA fraksiyonlarının preparatif ayrılması, tamamlayıcı DNA sekanslarının üretimi ve klonlanması için özellikle değerlidir. Ayrıca, nükleik asitleri kimyasal olarak sentezleme yeteneğindeki son gelişmelerle birlikte, oligonükleotitlerin kimyasal yan ürünlerden saflaştırılması, işlevlerinin doğruluğunu sağlamak için gereklidir.

Sulu çözeltideki nükleik asitlerin baskın özelliği, bu molekülleri iyon değişim kromatografisi ile ayırma için ideal aday yapan fosfat gruplarının iyonik doğasıdır.

Ters faz ayrımları, nükleik asit bazlarının zayıf hidrofobik doğası kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Doğal nükleik asitler, birçok farklı boyut sınıfında meydana gelir ve boyut dışlamayla grup ayrımları (örneğin ribozomal RNA ve transfer RNA arasında) da etkili olabilir. Bu yöntemlerin göreceli avantajları aşağıdaki bölümlerde açıklanmaktadır.

Anyon Değişimli HPLC

Nükleik asitlerin güçlü anyon değişimli durağan fazlar kullanılarak ayrılması çok popüler hale gelmiştir. Ayrılmalar, moleküllerin yüküne ve bunların silika desteğe bağlı üçüncül amonyum grupları ile etkileşimlerine bağlıdır.

Bu mod, küçük moleküllerin (21 nükleotid uzunluğundan daha az) çözünürlüğü için özellikle yararlıdır, çünkü n ve n +1 moleküllerinin nispi çözünürlüğü artan uzunluklarla (n) azalır.

Sabit fazın çözünen ve üçüncül amonyum ayırıcı kolu arasındaki hidrofobik kuvvetler, ayrılmayı etkileyebilir, ancak sulu tampon eluentine organik bir çözücünün eklenmesiyle en aza indirilebilir. Bununla birlikte, güçlü anyon değişim kolonlarından daha uzun moleküllerin geri kazanılmasının, sabit faza geri döndürülemez bağlanma nedeniyle nispeten düşük olduğuna dikkat edilmelidir.

Fosfat tamponları içeren mobil fazlar, oligodeoksinükleotidlerin preparatif saflaştırılmasında sıklıkla kullanılmaktadır, ancak, ürünün sonradan tuzdan arındırılması gerekliliği, bu tür mobil fazların kullanımını sınırlar: ayrıca, moleküller arası ve moleküller arası etkileşimler (hidrojen bağı) ile ilişkili problemler ortaya çıkabilir. – eluentte formamid dahil edilerek bunlar büyük ölçüde aşılabilir.

Alternatif bir mobil faz, liyofilizasyon ile çıkarılabilen ve içinde bu moleküler etkileşimlerin sınırlı olduğu sulu trietilamonyum asetattır. Silikanın polietilenimin ile yerinde yüzey modifikasyonu rapor edilmiştir ve oligonükleotitlerin zincir uzunluğu 35’e kadar çözünürlüğünü sağlar.

Büyük gözenek boyutuna sahip mikropartikülat iyon değiştiricilerin piyasaya sürülmesi, iyon değişim HPLC’nin uygulanmasını, 500 nükleotide kadar DNA sınırlama fragmanları gibi çok daha büyük moleküllere genişletmiştir.

Küçük oligonükleotidlerin ayrılması için anyon değişim, ters faz ve ters faz iyon çifti modlarının bir karşılaştırması, anyon değişiminin kolon ömrü daha kısa olabilse de en iyi çözünürlüğü sağladığı sonucuna varmıştır.

Ters Fazlı HPLC

Oligonükleotidlerin ters faz sabit fazlar üzerinde tutulmasına, nükleotid bazları ve durağan faz arasındaki hidrofobik etkileşimler hakimdir. Bu etkileşimler göreceli olarak spesifik nükleotid bazından bağımsız olduğundan, tutulma göreceli yük tarafından belirlenir ve daha yüksek yüklü moleküller önce ayrıştırılır.

Ters faz modu, ribo- ve deoksiribo-oligonükleotidlerin veya bunların 5′-fosforile türevlerinin ayrılması için kullanılmıştır. Tipik olarak, trietilamonyum asetat (pH 7.5) gibi zayıf bir sulu tampon içinde% 5 ila% 30 arasında bir asetonitril veya metanol gradyanı kullanılabilir.

The post Oligo ve Polinükleotidler – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).