Sıralı filtrelerin dahil edilmesiyle kromatografik kolonu partikül maddeden koruma ihtiyacı halihazırda tarif edilmiştir, ancak kolonun bazı çözünür bileşenlerden korunması için eşdeğer bir ihtiyaç da vardır.

Genellikle bu malzemeler numune hazırlama aşamasında çıkarılır; ancak ek bir önlem olarak sisteme bir koruma sütunu dahil edilebilir. Koruyucu sütunlar ana sütundan daha küçüktür.

Genellikle ana sütundakine benzer bir malzeme ile paketlenirler ve aksi takdirde ana sütunu tıkayabilecek çok yüksek k ‘değerlerine sahip bileşikleri etkin bir şekilde kaldırırlar. Koruyucu kolonlar, nispeten düşük maliyetleri nedeniyle sık sık değiştirilebilir ve böylece ana kolonun ömrünü uzatır. Koruyucu kolonların, kolon dışı bant genişleme etkilerine katkıda bulunarak kolon performansında bir bozulmaya neden olabileceği unutulmamalıdır ki bu açıkça da en aza indirilmelidir.

Mobil fazlarda kullanılan solvent, kolon destek materyalini yavaşça çözerek kolon performansında aşamalı bir kayba neden olabilir. Bu, 8’in üzerindeki pH değerlerinde çalışan silika bazlı sabit fazlarda yaygın bir sorundur.

Desteğin çözülmesi, kolon boşluklarının görünmesine neden olur ve performans kaybına neden olur. Bu problem, numune enjeksiyon noktasından yukarı akıştaki ana kolon ile aynı sabit fazı içeren küçük bir kolonun konumlandırılmasıyla durağan fazın önceden doyurulmasıyla aşılabilir.

Sütun Depolama

Sütunlar genellikle saf bir çözücü içinde, sütunun uçları sıkıca kapatılmış olarak saklanmalıdır. İyon çifti reaktifleri veya tamponları kullanılmışsa, korozyon olasılığını önlemek için bunlar kolondan en az 50 kolon hacmi ile iyice yıkanmalıdır.

Nükleotit çeşitleri
Nükleotit nükleozit farkı
Nükleotitler
Nükleik asit nedir
Nükleotit nedir
Nükleotit isimleri
Nükleik asit yapı taşı
Nükleotit yapısı

Hortum

Ara bağlantı borusunun ve bağlantı parçalarının hacmi, ekstra kolon bandı genişlemesine katkıda bulunur ve bu nedenle en aza indirilmelidir. Genel olarak, iç çapı 0,5 mm olan 1/16 inç çelik kılcal boru kullanılır, ancak 0,3 mm veya 0,2 mm iç çapa sahip borularla iyileştirilmiş bir performans elde edilebilir.

Swagelok sistemi gibi boru konektörlerinin kullanımında dikkatli olunmalıdır çünkü bağlantı her çözüldüğünde, daha sonra yeniden mühürlemek için biraz daha fazla güç gerekir. İlk etapta sürekli açma ve yeniden sıkma veya aşırı sıkma çözücü akışını ciddi şekilde bozarak yüksek geri basınçlara neden olabilir.

Bir contanın elde edilmesinin zor olduğu yerlerde PTFE bandı Swagelok bağlantı parçalarının etrafına sarılabilir. Ayrıca, bu konektörler içinde boşluklar oluşturmamak da önemlidir, çünkü bunlar ekstra sütun bant genişlemesini önemli ölçüde de artırabilir.

Bu tür boşluklara neden olan ana suçlu, zayıf boru uçlarıdır ve bunlar her zaman temiz ve dik olarak kesilmeli ve ardından ince bir korindon taşı ile düzeltilmelidir. Hortum daha sonra ultrasonik işlemden geçirilmeli, yıkanmalı ve metal tozları gidermek için de kurutulmalıdır.

Tespit etme

Çeşitli dedektör türleri, enstrümantasyon bölümünde açıklanmaktadır ve özel dedektör seçimi, bu bölümde açıklanan bir dizi kritere bağlı olacaktır. Bununla birlikte, genel performansı etkileyebilecek bir dizi genel noktadan da bahsedilmelidir:

(a) En yüksek genişletme etkileri, içsel detektör hücre hacminden ve bağlantı tüplerinden kaynaklanabilir. Bu nedenle, dedektör hücre hacmi, maksimum hassasiyeti koruyan bir seviyeye indirilmelidir.
(b) Yanıt süresi, dedektör çıktısının gerçek kromatografik elüatı yansıtmasına izin verecek kadar hızlı olmalıdır.
(c) Bileşik tespit edilebilirliği. İlgilenilen bileşiğin detektör tarafından tespit edilebileceğinin belirlenmesi önemlidir. Bu, bileşiğin fizikokimyasal özelliklerine bağlı olacaktır.
(d) Algılama hassasiyetini iyileştirmek için arka plan gürültüsü en aza indirilmelidir (özellikle iz analizi için). Elektriksel olarak ‘gürültülü’ ortamlar için şebeke voltajı tepe düzeltme cihazları da önerilir.

Tepe Tanımlama

Tutulma süresi ve referans bileşiklerle birlikte kromatografi, pik tanımlama için çok yararlı bir kılavuzdur, ancak daha fazla onay gerektirir ve bu amaç için aşağıdakileri içeren bir dizi yöntem kullanılmıştır:

(a) Kimyasal veya fiziksel karakterizasyon (örneğin, kütle spektrometrisi). (b) UV soğurma oranları.
(c) Durdurulmuş akış UV / floresan taraması.
(d) Enzimatik tepe kayması.
(e) Türevlendirme.

Bu çeşitli yöntemler, ayrı ayrı veya kombinasyon halinde kullanılabilir.

Veri işleme

Kromatografik piklerde malzeme miktarının belirlenmesi için iki yöntem vardır:

(1) Pik yüksekliğini (bu yaklaşık olarak pik alanıyla orantılıdır) veya pik alanını (özellikle stabil olmayan bir taban çizgisinin yaşanabileceği gradyan çalışması için) ölçmek için kayıt cihazı izinin doğrudan kullanımı. İlk yöntem basit ve hızlıdır, ancak açık bir şekilde asimetrik zirveler nedeniyle yerleşik yanlışlıklar vardır.
(2) Elektronik entegrasyon. Açıktır ki bu yöntem daha pahalıdır, ancak çok daha uygun ve daha doğrudur. Maalesef detektör yanıt faktörleri farklı bileşikler için değişiklik gösterir ve bu dikkate alınmalıdır. Türevlendirme, yanıt faktörlerini eşitlemenin iyi bir yoludur.

HPLC Uygulamaları

Nükleositler ve Nükleotidler

Sıvı kromatografi, nükleositlerin ayrılmasında en eski uygulamalarından birini buldu ve kısmen nükleik asit biyokimyasının anlaşılmasındaki hızlı gelişmeden sorumluydu. Daha sonra kromatografi, nükleik asit bileşiminin tanımlanmasında, nükleik asit metabolizmasının aydınlatılmasında ve ayrıca nükleotid havuzlarının miktarının belirlenmesinde geniş bir uygulama da bulmuştur.

Nükleik asit bileşenlerinin kolon sıvı kromatografik ayrılmasına ilişkin en eski rapor Cohn (1949) ‘da bulunabilir. O zamandan beri, sıvı kromatografi bu bileşenlerin ayrılması için en yaygın kullanılan yöntem de olmuştur.

Bazları, nükleositleri ve nükleotitleri ayırmanın standart yöntemi, basit polistiren tipi iyon değişim reçineleri üzerinde de iyon değişim kromatografıydı.

1967’de Horvath, hem stabil hem de nispeten verimli olan ve daha yüksek basınçların uygulanmasını sağlayan, böylece sitidin, üridin, adenozin, timidin mono-, di- ve trifosfatlarının hızlı bir şekilde ayrılmasını kolaylaştıran pelliküler iyon değişim sabit fazlar geliştirdi.

Gözenekli silikaya dayalı sabit fazların müteakip gelişimi, nükleotidleri ve bunların türevlerini hızla ayırabilen çeşitli kromatografik modlara yol açmıştır.

The post Nükleositler ve Nükleotidler – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).