FISH deneylerinde problar için en sık kullanılan etiketler, modifiye edilmiş deoksiüridin trifosfatlardır. Modifikasyonlar, pirimidin halkasının 5 pozisyonuna uzun bir aralayıcı kol ile bağlanan haptenlerin, digoksigenin veya biotin gibi immünoreaktif grupların eklenmesini içerir.

Bunlar dolaylı immünofloresan teknikleriyle tespit edilebilir. Alternatif olarak, problar, floresan gibi doğrudan kendi floresansıyla saptanabilen florokrom içeren nükleosit trifosfatlarla etiketlenebilir.

Problar, moleküler biyolojinin başka yerlerinde sıkça kullanılan sistemlerden herhangi biri kullanılarak etiketlenebilir. Bunlara polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), nick translasyonu ve rastgele primer etiketleme dahildir. Bunlar arasında, küçük boyutlu etiketli DNA parçaları üreteceğinden, nick çevirisi muhtemelen en popüler olanıdır.

Büyük prob molekülleri hedef DNA’larına ulaşmak için sitolojik materyalden difüze olmakta zorlandığından ve kullanımları sıklıkla yüksek arka plan floresansıyla sonuçlandığından, probun boyutu önemlidir. Optimum prob boyutu 200 ile 500 baz arasındadır. PCR ile üretilen problar, daha sonra detaylı olarak anlatılacak olan kromozom boyama ve fiber FISH tekniklerinde giderek daha fazla önem kazanmaktadır.

FISH yöntemi PDF
Fish yöntemi nasıl uygulanır
İn situ hibridizasyon nedir
Nükleik asit hibridizasyon Yöntemleri
Hibridizasyon Yöntemleri
İn situ hibridizasyon yöntemi
İn situ hibridizasyon aşamaları
Fish yöntemi ne kadar güvenilir

Hibridizasyon

Burada prosedürler genel olarak diğer moleküler nükleik asit hibridizasyon protokollerininkileri takip eder. Farklılıklar, sitolojik preparasyonun morfolojisini iyi durumda tutmaya ve probun genom boyunca dağılmış tekrarlanan dizilere bağlanmasını önlemeye yönelik girişimlerle ilgilidir.

Sitolojik preparasyonun bütünlüğünü korumak için, hibridizasyon genellikle %50 formamid içinde tipik olarak 35-42 C gibi düşük sıcaklıklarda gerçekleştirilir. Çoğu ökaryot genomu, büyük miktarlarda dağılmış tekrarlanan DNA dizileri içerir. Bu nedenle, sonda olarak genomik materyal kullanılırsa, genomun başka yerlerinde tekrarlanan DNA dizilerini içermesi muhtemeldir.

Bu, kromozomların tüm bölgelerinde bir flüoresans düzeyi ile sonuçlanacak ve bu da probun özgüllüğünü azaltacaktır. Bunu önlemek ve böylece nihai görüntünün kalitesini ve hassasiyetini iyileştirmek için, genomun tekrarlayan fraksiyonundan (Cot 1 DNA) etiketlenmemiş DNA genellikle hibridizasyon sırasında proba eklenir.

Hibritleştirilmiş Probun Tespiti

Problar doğrudan floresan nükleotidlerle etiketlendiğinde, saptama için uygun filtrelerle bir floresan mikroskobu kullanılarak malzemenin gözlemlenmesi yeterlidir. Sinyal amplifiye edilmediğinden, bu yöntem daha az yoğun floresan ile sonuçlanacaktır, ancak arka plan floresan seviyesi düşüktür.

Düşük seviyeli floresansı tespit etmek için birleştirilmiş şarj cihazı (CCD) kameralarının kullanılması, bu yöntemi küçük DNA hedefleriyle kullanım için yeterince hassas hale getirebilir. Problar haptenlerle etiketlendiğinde, bunların varlığı florokromlara konjuge edilmiş antikorlarla tespit edilir.

Digoksigenin ve biyotin etiketli probların her ikisi de bu şekilde saptanabilir, ancak biyotinin yumurta beyazı proteini olan avidin için son derece yüksek bir afiniteye sahip olması gibi ek bir avantajı vardır.

Bu, tespitte kullanılmak üzere florokromlarla konjuge avidin kullanımına izin verir. Bu tekniğin tek dezavantajı, hedef dokunun arka plan floresansına yol açacak kadar biyotin içermesidir. Sitogenetik durumunda bu büyük bir sorun değildir.

Bir hedeften gelen flüoresan sinyali, tespit sürecinde sıklıkla birden fazla antikor katmanı kullanılarak yükseltilir.
FISH teknolojisinin en büyük avantajlarından biri, farklı haptenlerle etiketlenmiş bir dizi prob ile birlikte farklı florokromların aynı anda kullanılabilmesidir.

Sonuç, iki renkli bir FISH görüntüsüdür. Örneğin, iki prob aynı kromozom preparasyonuna hibridize edilebilir. Biri biotin ile etiketlenmiş ve floresan konjuge antikorlar ile tespit edilmişse ve diğeri digoksigenin ile etiketlenmiş ve Teksas kırmızısı kullanılarak tespit edilmişse, o zaman her iki lokus yeşil veya kırmızı floresan alanları olarak aynı anda tespit edilecektir.

Bu yaklaşım, aynı deneyde doğrudan etiketlenmiş problar kullanılarak veya iki hapten karışımı ile etiketlenmiş problar kullanıldığında da genişletilebilir. Bu tür problar, iki farklı florokroma konjuge edilmiş antikorlar tarafından tespit edilirse, sonuç bir ara renk sinyalidir; Texas kırmızı floresansı floresandan gelen kırmızı ve yeşil floresan turuncu bir sinyal verecektir.

Bir dizi sonda, aynı iki haptenin farklı oranlarıyla etiketlenebilir. Ortaya çıkan floresan, bir CCD kamerada dijital bir sinyale dönüştürülebilir ve özel yazılım, floresandaki ince farklılıkları tanıyacaktır. Bunlara daha sonra sahte renkler tahsis edilecektir. Bu yaklaşım, daha sonra açıklanacak olan spektral karyotiplemenin geliştirilmesine yol açmıştır.

Probların saptanmasından sonra, probun hibridize olmadığı kromozomların veya çekirdeklerin kalan alanlarını saptamak gerekir. Bu, florokromlar 4,6-diamino-2-fenil-indol (DAPI), Hoechst 33258 veya propidyum iyodür kullanılarak yapılır.

DAPI ve propidium iyodür kombinasyonları, kromozom tanımlamasında yardımcı olabilecek bir bantlama modeli üretecektir. Ancak propidium iyodür, birden fazla dalga boyu tarafından uyarılması ve birkaç farklı dalga boyunda floresan yayması nedeniyle, monokrom CCD kameralar kullanılarak görüntülerin çekildiği durumlarda sorunlara neden olabilir.

Temel araştırmalarda uygulamalar

Bu teknoloji potansiyel olarak tüm ökaryot türleri ile kullanılabilse de, bu bölüm insan genetiğindeki kullanımlara odaklanacaktır. FISH, spesifik kromozomal bölgelerden gelen genleri veya diğer DNA dizilerini saptamak için kullanılabilir.

Deneyin gerektirdiği kesinlik, kullanılacak yaklaşımı belirler. En basit düzeyde, süreç, ‘kromozom boyama’ olarak bilinen bir teknik olan tüm kromozomları tanımlamak için kullanılabilir. Bu durumda, bir prob yapmak için DNA’yı tek bir insan kromozomundan izole etmek gerekir.

Bu iki yoldan biriyle gerçekleştirilir. Başlangıçta, kemirgen insan somatik hücre melezleri bir DNA kaynağı olarak kullanılmıştır. Bu hücre melezlerinde sadece tek bir insan kromozomu içeren klonları izole etmek mümkündür.

DNA, bu tür klonlardan izole edilir ve insan DNA’sı, alu dizilerine tamamlayıcı primerler kullanılarak spesifik olarak amplifiye edilir. Bunlar, insanda bulunan ancak kemirgen DNA’sında bulunmayan oldukça tekrarlanan bir diziyi temsil eder.

Floresanla aktive olan hücre sınıflandırması (FACS) kullanılarak spesifik insan metafaz kromozomlarını doğrudan izole etmek artık mümkün. Saflaştırılmış kromozomların peletinden elde edilen DNA, dejenere primerler kullanılarak PCR ile amplifiye edilir. Bu, artık kromozom boyalarının ticari tedarikçileri için tercih edilen yöntemdir.

The post Probların Etiketlenmesi – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).