DNA çift sarmalının keşfinden elli yıl sonra, Homo sapiens’in referans dizisi açıklandı. İnsan genomundaki 3 milyar DNA harfini sıralamaya yönelik uluslararası çaba, heyecan verici yeni bir genomik çağı başlattı. DNA mikrodizileri, özellikle gen ekspresyonu alanında, haritalanmamış genomik bölgenin sömürülmesinde önemli bir yardımcı sağlar.

Belirli bir canlı organizmadaki binlerce genin ve ürünlerinin (yani RNA ve proteinler) karmaşık ve orkestrasyonlu bir şekilde işlev gördüğüne ve çeşitli teşhis ve tedavi yöntemleri için potansiyel barındırdığına dair yaygın bir inanış vardır.

Moleküler biyolojideki geleneksel yöntemler genellikle “bir deneyde bir gen” temelinde çalışır, bu da verimin çok sınırlı olduğu ve gen fonksiyonunun “bütün resminin” elde edilmesinin zor olduğu anlamına gelir.

Son birkaç yılda, DNA mikrodizisi adı verilen yeni bir teknoloji, biyologlar arasında artan bir ilgi gördü. Bu teknoloji, binlerce genin ekspresyon seviyelerine ilişkin verileri aynı anda üreten tahlilleri içerir. Bu tesis, iş hacminde çarpıcı bir artışı temsil etmektedir.

Dizi, örneklerin düzenli bir şekilde düzenlenmesidir. Bilinen ve bilinmeyen DNA örneklerini baz eşleştirme kurallarına göre eşleştirmek ve bilinmeyenleri tanımlama sürecini otomatikleştirmek için bir ortam sağlar.

DNA mikrodizisi veya DNA çipleri, tamamlayıcı bağlanmayı belirlemek için bilinen özdeşliğe sahip probların kullanıldığı katı bir matris/substrat üzerinde yüksek hızlı robotik ile üretilir, böylece büyük ölçüde paralel gen ekspresyonu ve gen keşif çalışmalarına izin verilir. Mikrodizilerdeki örnek nokta boyutları tipik olarak 200 mm’den küçüktür ve bu diziler genellikle binlerce nokta içerir.

Mikrodizi pazarı, son yıllarda endişe verici bir hızla büyüdü. Bu teknolojinin fiyatı düştükçe, ev yapımı kendin yap seçeneklerinden şu anda mevcut olan genişleyen ticari cihaz yelpazesine doğru bir kayma eğilimi olmuştur.

Mikroarray teknolojisi Nedir
Dna mikroarray yöntemi nedir
Microarray ne demek
Affymetrix microarray
DNA Mikroarray yöntemi
DNA microarray
Mikroarray PDF
Mikrodizin Analizi Nedir

Affymetrix GeneChip Teknolojisi

Affymetrix oligonükleotid dizileri, fotolitografi ve kombinatoryal kimyayı birleştiren bir süreç kullanılarak sentezlenir. Diziler, doğal olarak hidroksile olan bir kuvars levhadan oluşur.

Çip üzerindeki belirli konumlara belirli nükleotidlerin sıralı olarak eklenmesine izin veren bir dizi fotolitografik maske üretilir. Sentezin ilk adımında maskenin üzerine ultraviyole ışık yansıtıldığında, açığa çıkan bağlayıcıların koruması kaldırılır ve nükleotid eşleşmesi için kullanılabilir hale gelir.

Tek tip nükleotid solüsyonu daha sonra gofret yüzeyi üzerinde yıkanır ve aktive edilmiş bağlayıcılara bağlanır. Bir sonraki adımda, bir sonraki koruma kaldırma ve birleştirme turu için gofret üzerine başka bir maske yerleştirilir. İşlem, Şekil 53.1’de gösterildiği gibi, problar tam uzunluklarına ulaşana kadar sırayla tekrarlanır.

Bireysel genler, bir dizi (tipik olarak 11-20) farklı 25-mer ‘mükemmel eşleşme’ oligonükleotidleri kullanılarak GeneChip üzerinde temsil edilir. HG-U133 seti, prob seti başına 11 prob çifti içerir. Prob setleri, mRNA’nın bu kısmı en verimli şekilde etiketli hedefe dönüştürüldüğünden, poli-A bölgesinden genellikle 600 bp yukarı akış içinde yer alır.

Problar, seçilen gene veya eksprese edilmiş dizi etiketine (EST) tamamlayıcılıklarına, diğer ilgili genlere göre benzersizliğine ve tahmin edilen hibridizasyon özelliklerine göre seçilir. Her bir mükemmel eşleşme (PM) oligonükleotid probu seti için, dizide bir çiftli uyumsuzluk (MM) prob seti de mevcuttur.

MM probları için kullanılan oligonükleotit dizisi, PM probuyla aynıdır ancak merkezi konumda tek bir nükleotit ikamesi vardır. Spesifik hibridizasyon sinyali, PM floresan sinyalinden MM problarından flüoresan sinyali çıkarılarak belirlenir ve belirli bir geni temsil eden tüm prob çiftlerinin ortalaması alınır. Bu ortalama floresan sinyali, transkript bolluğunun bir ölçüsüdür.

Affymetrix yazılım saptama algoritması, bir saptama p değeri oluşturmak ve her bir gen için bir mevcut/yok çağrısı atamak için prob çifti yoğunluklarını kullanır. Bir sonda setindeki her bir sonda çifti, her bir sonda çifti için hesaplanan ve önceden tanımlanmış bir eşik olan Tau ile karşılaştırılan bir ayrım puanına sahiptir.

Ayırım puanı, amaçlanan hedefini tespit etme yeteneğini tanımlayan bir sonda çiftinin temel bir özelliğidir. Genel hibridizasyon yoğunluğuna göre prob çiftinin (PM–MM) hedef spesifik yoğunluk farkını ölçer. Tau’dan daha yüksek puanlara sahip prob çiftleri, transkriptin varlığına oy verir.

Tau’dan daha düşük puana sahip araştırma çiftleri, not dökümünün yokluğuna oy verir. Algılama çağrısının güvenini yansıtan bir p değeri de oluşturulur. Bu strateji, düşük hedef konsantrasyonlarda yüksek hassasiyete izin verir ve yakından ilişkili diziler arasında ayrım yapma yeteneğini korur.

Etiketli hedef ve kontrolün aynı diziye hibritlendiği iki renkli bir hibridizasyon yaklaşımı kullanan cDNA mikrodizilerinin aksine, her Affymetrix GeneChip tek bir RNA örneğini analiz etmek için tasarlanmıştır.

mRNA, bir T7 RNA promotör bölgesini içerecek şekilde tasarlanmış bir oligo d(T) primeri kullanılarak ters transkripsiyon yoluyla çift sarmallı cDNA’ya dönüştürülür. Biyotin etiketli nükleotitler, bir T7 polimeraz ile in vitro transkripsiyon yoluyla doğrudan cRNA hedefine dahil edilir. Etiketli cRNA, < 200 bp’lik parçalara bölünür ve GeneChip’e hibridize edilir. Floresan sinyali, Gene-Chip’in streptavidin fikoeritrin ile boyanmasından sonra elde edilir.

SNP profilleme ve DNA dizileri

Karmaşık genetik hastalıklar, genomun bölgelerini ve ölçülebilir bir fenotipten sorumlu genleri tanımlamak için yeterli gücü sağlamak için binlerce belirteç ve yüzlerce örnek gerektirir. Tek nükleotid polimorfizmlerinin (SNP’ler) insan genomunda ortalama olarak her 1000 bazda bir meydana geldiği tahmin edilmektedir. Bu polimorfizmler, kanserde bağlantı, ilişki ve heterozigotluk kaybı dahil olmak üzere birçok uygulama için genetik belirteçler olarak kullanılma potansiyeline sahiptir.

Mevcut SNP genotiplendirmesi, potansiyel olarak maliyeti artıran ve tek bir deneyde test edilebilecek SNP markörlerinin sayısını sınırlayan bir uygulama olan lokusa özgü primerlerin kullanımını içerir. Ancak Affymetrix, bir GeneChip1 Mapping 10 K Dizisi başlattı.

Bu sistem, lokusa özgü PCR’ye dayanmayan tek bir ölçeklenebilir deneyde 10.000’den fazla SNP’yi test edebilir. Şirket, numune başına 100.000’den fazla SNP’yi analiz etmek için yakın gelecekte iki dizili bir set (Centurion) başlatmayı teklif ederek tüm genom ilişkilendirme çalışmalarını mümkün kılıyor.

GeneChip1 Mapping 10 K Dizisi ve sonraki Centurion dizileri, tüm genom örnekleme analizine (WGSA) dayanır. Bu şema, 10.000’den fazla SNP içeren bir mikrodiziye verimli hibridizasyona izin vermek için tüm genomun karmaşıklığının azaltılmasına yönelik genel bir yaklaşımdır.

Test dört basit adımda yürütülür: genomik DNA’nın kısıtlama sindirimi; belirli bir adaptörün ligasyonu; bir PCR primeri ile amplifikasyon; ve DNA’nın parçalanması; ardından diziye etiketleme ve hibridizasyon gerekir.

Centurion dizileri için, PCR amplifikasyon adımı, tercihen 500-2000 bp’lik fragmanları amplifiye etmek için Pfx enzimini kullanır ve genomun karmaşıklığını toplamda yaklaşık 300 MB’a düşürür. Bu karmaşıklık azaltma, her dizide 50 000’den fazla SNP için allele özgü hibridizasyon ile doğru genotiplemeye izin verir ve testin giriş gereksinimleri dizi başına yalnızca 250 ng insan DNA’sı veya set için 500 ng gerektirir.

The post Affymetrix GeneChip Teknolojisi – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).