Halen kullanılmakta olan (aşağıda açıklanan) bu basit yöntem, ‘Ouchterlony yöntemi’ olarak anılmaya devam etmektedir. Grabar ve Williams 1953’te serum proteinlerinin tüm seruma poliklonal antikorlar kullanarak immünopresipitasyon (kalitatif immünoelektroforez) ile elektroforetik ayrımını birleştirdiler ve serum proteinlerinin heterojenliğinin gerçek doğası kabul edildi.

Hayvanlarda spesifik proteinler saflaştırılmaya ve onlara karşı antikorlar üretilmeye başlandığında, spesifik kantitatif immün analizler mümkün hale geldi. Radyal immünodifüzyon (Mancini tekniği) 1965’te tanıtıldı ve bu da hala rutin olarak kullanılmaktadır.

Nicel protein testinin duyarlılığı o zamandan beri radyo-immunoassayler ve enzim-immunoassayler ile birkaç ng/ml mertebesine kadar gerçekçi ölçümlere izin vererek geliştirildi.

Kalitatif Teknikler

Elektroforez

Serum protein elektroforezi, sınırlı çözünürlük vermesine rağmen, brüt protein anormallikleri için numuneleri analiz etmek için temel bir yöntemdir. Jel elektroforezi için destek ortamı genellikle bir selüloz asetat membran veya agaroz jeldir.

Tamponlar değişiklik gösterir, ancak genellikle pH’ı yaklaşık 8,5 olan barbitona dayanır. Rutin elektroforez için jeller veya membranlar ticari olarak mevcuttur ve bunlar, hazırlama süresini en aza indirmek ve tutarlı sonuçlar sağlamak için sıklıkla kullanılır.

Destek membranı, her iki ucundan tampon çözeltisine bağlanan bir elektroforez tankına yerleştirilir. Analiz edilecek numune katot ucuna yüklenir ve 30 dakika ile 1 saat arasında bir elektrik akımı uygulanır. Numunedeki proteinler, yükleriyle orantılı oranlarda akım içinde göç ederler.

Elektroforetik ayırmanın tamamlanmasından sonra, jel veya membran çıkarılır ve proteinler, genellikle asetik asit çözeltisi içinde fiksasyon yoluyla çözünmez hale getirilir ve uygun bir protein boyası ile boyanarak görselleştirilir.

Jel, dansitometri ile yarı nicelleştirilebilir; yani jel, boyama yoğunluğunu ölçen bir yoğunluk ölçer kullanılarak taranır.

Yalnızca 0,1-0,5 g/l veya daha yüksek konsantrasyona sahip proteinler, görülen serum protein bantlarına katkıda bulunacaktır ve bunların genellikle altı tanesi temsil edilir.

Kalitatif araştırma Yöntemleri
Kalitatif ve kantitatif yöntemler
Kalitatif araştırma yöntemleri nelerdir
Kalitatif nedir
Kantitatif veri nedir
Kantitatif Nedir
Kalitatif araştırma örnekleri
Kantitatif araştırma nedir

Bunlar elektroforetik hareketlilik sırasına göre şu şekilde gösterilir:

1. Albümin bandı (serum albümini ile temsil edilir).
2. 1 bant (genellikle 1-antitripsin, orosomukoid ve -lipoprotein ile temsil edilir).
3. 2 bant (haptoglobin ve 2-makroglobulin ile temsil edilir).
4. 1 bant (transferrin ile temsil edilir).
5. 2 bant (kompleman proteinleri ve -lipoprotein ile temsil edilir).
6. Bant (immünoglobulinler IgG, IgM ve IgA ile temsil edilir).

Bu yöntem için eşiğin altındaki konsantrasyonlarda kanda bulunan çoğu serum proteini, görülen bantlara katkıda bulunmaz. Yine de, immünolog için elektroforezden elde edilen belki de en alakalı bilgi, immünoglobulin eksikliğinin veya monoklonal gamopatilerin saptanmasıdır.

İmmünoglobulinler genellikle birçok farklı antikor molekülünü temsil ettiğinden, doğası gereği heterojendirler ve ayrı bir bantla temsil edilmezler. Bunun yerine, monoklonal (veya ‘M’) bir bant olmadığı sürece bu bant geniş bir yayma olarak görülür.

Monoklonal gamopati durumlarında, ağırlıklı olarak, immünoglobulin üreten hücrelerin tek bir genişletilmiş klonu, bir izotipin (IgG, IgM veya IgA) immünoglobulininin ayrı özgüllüğü ile üretimi vardır.

Bu immünoglobulin molekülleri bu nedenle esasen özdeştir ve ayrı bir veya M bandı üretir. Serumdaki monoklonal M proteininin doğasının ve idrardaki serbest hafif zincirlerin (Bence-Jones proteinleri) tanımlanması, proteinin destek ortamında elektroforezden sonra her izotipe özel bir antikorla çökeltilmesiyle immünofiksasyon kullanılarak gerçekleştirilebilir. Çökelmemiş proteinler yıkanır ve kalan çökelti bir protein boyası ile boyanarak görselleştirilir.

M proteini ayrıca immünodifüzyon veya immünoelektroforez ve kantitatif immünoanaliz ile ölçülen konsantrasyon ile de karakterize edilebilir (bu yöntemler aşağıda açıklanmıştır). Buna karşılık, azaltılmış bir bant, bir immünoglobulin eksikliğini düşündürür ve bu, kantitatif tahlil ile daha fazla araştırılmalıdır.

Jellerdeki DNA dizilemesinin yerini büyük ölçüde kılcal sistemler aldığı gibi, protein elektroforezi de artık sıvı faz içeren kılcal damarlarda gerçekleştirilebilir. Beckman-Coulter örneği CZE 2000 buna bir örnektir.

90 dakikada 70 örnek olmak üzere birçok örneğin hızlı analizine izin verecek şekilde tasarlanmıştır. Çözünürlük jellerinkine benzer. Gerçekten de, bir jel dansitometri taramasına eşdeğer formata sahip olan sonuç, lekeli bir jelin simüle edilmiş görüntüsünü vermek için ‘tersine çevrilebilir’.

Ouchterlony İmmünodifüzyon

İmmünodiffüzyon genellikle agar veya agaroz jellerde gerçekleştirilir. Klasik olarak, rozetin ortasında bir kuyu da olacak şekilde jele bir kuyu rozeti kesilir. Merkezi kuyu, test numunesi ile doldurulur ve her bir kuyuyu çevreleyen rozet, farklı spesifikliğe sahip bir antiserum ile.

Jel, nemli bir atmosferde birkaç saat inkübe edilir. Merkezi kuyudaki ve rozetteki proteinler jele yayılır. Örnek, antiserumlardan birinin yükseltildiği bir protein içeriyorsa, bir çökelti oluşmaya başlar; bu çökelti “eşdeğerlik” konsantrasyonlarında çözünmez.

Jeller, arşivleme için yıkanabilir, kurutulabilir ve boyanabilir. Bu yöntemi kullanarak, test örneğinde aynı anda birkaç proteinin varlığı tespit edilebilir. Alternatif olarak, merkezi kuyuya spesifik bir antiserum ve çevreleyen kuyucukların her birine farklı bir test numunesi koyarak belirli bir proteinin varlığı için birkaç test numunesi analiz edilebilir.

Ticari olarak temin edilen ‘Ouchterlony’ plakaları mevcuttur, örn. bir serum örneğinde bir paraproteini temsil eden izotipi ve alt sınıfı belirlemek gerekir.

NOT: Agaroz jele kesilmiş kuyuların klasik ‘rozet’ modelini gösteren Ouchterlony immünodifüzyonu. Merkezi kuyuya bir antikor (tavşan veya koyun gibi bir hayvanda yetiştirilen) konuldu ve serum numuneleri çevreleyen uydu kuyulara yerleştirildi. Üstteki kuyudaki serum, ilgilenilen proteini içeriyordu.

Antikor molekülleri, jel boyunca ve alt kuyudan yayılan proteinle buluştuğu yerde radyal olarak dağılmıştır. Protein (antijen) molekülleri, antikor molekülleri tarafından bağlanarak görünür, çözünmez bir çökelti ile sonuçlanır.

The post Kalitatif Teknikler – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).