Genetik mühendisliğindeki son gelişmeler, saflaştırmayı kolaylaştırmak için proteinlerin yapısını değiştirme olasılığını yaratmıştır. Spesifik bir proteini kodlayan genlerin manipüle edilmesiyle, füzyon peptidleri, saflaştırılmalarına yardımcı olan N ve C terminallerine eklenebilir.

Peptit uzantıları daha sonra çıkarılır ve protein, geleneksel saflaştırma yöntemleriyle geri kazanılır (Shine ve diğerleri, 1980). Belirli bir yöntem, bir dizi arginin kalıntısının eklenmesiyle izoelektrik noktayı büyük ölçüde değiştirmek için proteinin C-terminalini kullanır.

Ligandları N-terminaline bağlayan diğer birçok “saflaştırma füzyonunun” aksine, bu, proteinin doğru şekilde katlanmasına izin verir. Katyon değişim kromatografisi ile ilk saflaştırmadan sonra, arginin kalıntıları bir ekzopeptidaz (karboksipeptidaz B) ile uzaklaştırılabilir, böylece ilgilenilen proteinin pl’si değiştirilir ve daha sonra ikinci bir katyon değişim aşaması çıkarılır.

Protein, bu ikinci aşamada farklı bir pozisyonda ayrıştırılırken, kirleticiler değişmeden kalacaktır (C-terminalinde bir dizi arginin kalıntısına sahip olmadıkları sürece).

Bu metodoloji, proteinleri önceden planlanmış saflaştırma prosedürlerine uyacak şekilde tasarlama heyecanını sunar. Belki gelecekte tüm proteinler için tek bir işlem kullanmak mümkün olabilir (birincil dizinin önceden bilinmesi şartıyla).

Aşağıdaki bölümler, HPLC’nin proteinlerin, peptitlerin ve amino asitlerin izolasyonunda ve analizinde kullanılan çeşitli yöntemlere uygulanmasını tartışmaktadır. Gözetimsiz gradyan geliştirmeye izin veren enstrümantasyonla birleştirilmiş yeni sabit fazların geliştirilmesi, saflaştırma görevini dönüştürmüştür. Bu yönlerden bazıları da bu bölümde tartışılacaktır.

 İyon Değiştirici Kromatografi

İyon değişim kromatografisi (IEC), proteinlerin ayrılması için en yaygın kullanılan moddur, çünkü optimum kromatografik koşullar, karmaşık biyopolimerlerin ikincil ve üçüncül yapısının korunması ile uyumludur.

IEC’de bir çözünen maddenin tutulması iyonik kuvvet, pH ve sıcaklık değiştirilerek kontrol edilebilir. Ek olarak, bu parametrelerin iyileşmeyi de etkileyebileceği gözlemlenmiştir.

Bununla birlikte, mobil faz seçimi çoğu protein için ampiriktir ve bir saatten daha kısa çalışma süreleri (yeniden dengeleme dahil) kullanarak kromatografik koşullar geliştirme yeteneği bu nedenle oldukça faydalıdır. Silika veya organik polimere dayalı yüksek performanslı anyon ve katyon değiştiriciler artık yaygın olarak kullanılmaktadır ve önceki sabit faz türlerinde bulunmayan bir kararlılık derecesine sahiptirler.

IEC proteinleri için kullanılan sabit fazlar, büyük bir gözenek boyutuna (30-50 nm) sahip olan küresel boncuklardan oluşur. Büyük gözenek boyutu mekanik mukavemeti azaltır ve bu nedenle daha düşük çalışma basınçları gerekir (tipik olarak 1 ml / dakikada 500 psi’den büyük değildir).

IEC proteinleri için en popüler ve başarılı sabit faz türleri, Toyo Soda’dan polimer bazlı TSK-PW, Pharmacia’dan FPLC Mono Beads ve Synchrom Inc.’den silika bazlı Synchrom boncuklarıdır.

Polimer bazlı sabit fazlar, yüksek pH değerlerinde (> pH 8.0) silika ile ilişkili çözünme problemlerinden muzdarip olmadıklarından daha geniş bir pH aralığında (pH 2.0-pH 10.0) kullanılabilir.

Bu durağan aşamalar bu nedenle daha popülerdir. Yeni TSK-5PW-SP sabit fazdaki (500 ml yatak hacmi) hazırlayıcı ayırmalar, analitik boyutlu bir kolon üzerinde elde edilenlerle karşılaştırılabilir sonuçlar vermiştir (Brewer ve diğerleri, 1986), böylece gram miktarlarının hazırlanması için ölçek büyütmeye izin verir.

Katyon değişimi kullanılarak doku kültüründen insan gama interferonunun saflaştırılmasında bir ara aşama  gösterilmektedir. 10 mM sodyum fosfat, pH 7.0 içinde dengelenmiş bir Mono-S sabit faz, dengeleme tamponunda% 20 etilen glikol ile kullanıldı. Elüsyon, gösterildiği gibi doğrusal bir tuz konsantrasyonu ile gerçekleştirildi.

Jel filtrasyon kromatografisi nedir
Afinite kromatografisi nedir
Adsorpsiyon kromatografisi Nedir
Afinite kromatografisi çalışma prensibi
Kolon kromatografisi nedir
İyon değişim kromatografisi nedir
İyon exchange kromatografisi
İyon kromatografisi nedir

Ters Faz Kromatografisi

Büyük proteinlerin (> 30 kDa) kromatografisi için geniş gözenekli yüksek performanslı ters faz desteklerinin getirilmesi, bu sabit fazların her boyuttaki proteinler için kullanılmasını teşvik etmiştir.

Teoride, geniş gözenekli sabit fazlar, yalnızca moleküller daha küçük gözeneklere girmekten dışlanacak kadar büyük olduğunda gereklidir. Genel olarak, daha küçük gözenek boyutlu sabit fazların kullanılması yararlıdır çünkü bunlar, bağlanma için mevcut yüzey alanındaki artıştan dolayı daha büyük bir verime sahiptirler.

Böylece, küçük bir protein için, daha küçük gözenek boyutlu sabit fazda daha yüksek bir plaka numarası (N) elde edilecektir. Birçok biyolojik olarak aktif protein, organik çözücüler tarafından veya ters fazın normal olarak çalıştığı düşük pH ile denatüre edilebilmesine rağmen, diğer proteinlerin, mobil fazın çıkarılması üzerine yeniden katlanma yeteneklerinden dolayı oldukça stabil olduğu bulunmuştur.

Belirli durumlarda, özellikle protein sekans analizi için saflaştırılıyorsa, biyolojik aktivitenin sürdürülmesi gerekli olmayabilir.

Ters fazlı bir protein ayırma örneği,  gösterilmektedir, burada Tip I ve I11 kolajenin (300 kDa) olgun formlarının, geniş gözenekli bir deri üzerinde 30 dakikadan daha kısa bir sürede tamamıyla ayrılması sağlanmıştır. Asetonitrilin trifloroasetikasidin bir aşamalı gradyanı kullanılarak Cı sabit faz. Kromatografiden 30 dakika önce 56 ° C’de denatürasyon, ayrı alt birim zincirlerinin çözülmesine izin verdi.

In vivo alt nanomol miktarlarında bulunmalarına rağmen ters faz kromatografisi kullanılarak başarıyla izole edilmiş proteinlerin uzun bir listesi vardır. Bunlar, kolajen, kan proteinleri, enzimler, hormonlar, glikoproteinler gibi yapısal proteinleri ve insan büyüme hormonu ve epidermal büyüme faktörü gibi farmasötik açıdan ilginç proteinleri içerir.

Ek olarak, proteinlerdeki konformasyonel değişiklikleri incelemek, protein hidrolizatlarında sistein içeren peptitleri tanımlamak ve küçük ve büyük moleküller arasındaki kromatografik davranış farklılıklarını incelemek için ters faz kromatografisi kullanılmıştır.

Ters fazlı kromatografide proteinlerin tutulma mekanizması açıkça tanımlanmamıştır, ancak çözünürlük kaybı olmadan daha kısa kolonlar kullanma yeteneği, işlemin tek başına basit bölme kromatografisi ile kontrol edilmediğini göstermektedir.

Bu nedenle, kolon verimliliğini değerlendirirken, basit organik moleküller yerine bir dizi hidrofobikliğe sahip bir protein karışımından oluşan bir standardın kullanılması önemlidir. Ek olarak, bu, kısa kolonlu sistemlerin, maliyette önemli bir tasarruf sağlayacakları için protein ayırmaları için en uygun olabileceği anlamına gelir.

The post  İyon Değiştirici Kromatografi – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).