Mobil fazın saflığı, özellikle bir analizin yüksek algılama hassasiyeti gerektirdiği durumlarda, iyi HPLC ayrımlarının elde edilmesinde çok önemli bir faktördür. Çözücülerdeki safsızlıklar, çözülmüş sıvılardan veya gazlardan veya asılı partiküllerden kaynaklanabilir.

Bu katışkılar, kolon paketinin yüzeyine adsorbe olabilir ve seçiciliğinde bir değişikliğe neden olabilir veya alternatif olarak, artan seçici mukavemete sahip tek bir pik olarak ayrışabilir. Neyse ki, HPLC için özel olarak damıtılmış veya saflaştırılmış, büyük ölçüde çözünmüş yabancı maddeler içermeyen bir dizi şirket market solventidir.

Tipik safsızlıklar arasında daha düşük veya daha yüksek homologlar, asitler ve bazlar, UV emici bileşikler ve su bulunur. Analitik ayırmalar için laboratuar deiyonize su genellikle yeterince saf değildir.

Suyu daha kapsamlı bir şekilde arıtmak için yöntemler yayınlanmıştır ve HPLC dereceli su artık ticari olarak mevcuttur. Okuyucu, ayrıntılı bir çözücü saflaştırma kılavuzu için diğer kaynaklara yönlendirilir.

Çözünmüş gazlar, gazın çözünürlüğünün karışımda tek çözücüden daha az olabildiği gradyan sistemlerinde özel bir problemdir; Bu, organik çözücünün buharlaşmasıyla sonuçlanabilen, sudaki hidrojen bağlarının ekzotermik kırılmasından dolayı su ve metanol veya asetonitrilin karıştırıldığı durumlarda önemli bir problem olabilir.

Bununla birlikte, sulu elüentte küçük bir metanol yüzdesinin önceden karıştırılması bu sorunu en aza indirecektir. Düşük basınçlı HPLC sistemlerinde, karıştırma bölmesindeki gazın alınması, kolon performansında sonuç olarak bir kayıpla birlikte kromatografik kolon üzerine pompalanan gaz kabarcıklarına neden olabilir.

Organik çözücüler ve kullanım alanları
Organik çözücüler nelerdir
kristallendirme ile saflaştırmada izlenecek yolun basamaklarını yazınız.
Yağları çözen organik çözücüler
İnorganik çözücüler
7) kristallendirme ile saflaştırmada izlenecek yolun basamaklarını yazınız.
Kristallendirme ile saflaştırmada izlenecek yolun basamakları
Kristalizasyon hakkında Genel Bilgi

Bununla birlikte, HPLC kolonu kullanım sırasında basınç altında olduğu için, gaz giderme genellikle kolonun çıkış (düşük basınç) tarafındaki tüpte meydana gelir ve detektör hücresinde daha sonra aşırı sinyal gürültüsü yaratabilen gaz kabarcıklarına yol açar.

Genel olarak, gazdan arındırma prosedürleri aşağıdakilere dayanır; (a) kaynatma, (b) vakumla gazdan arındırma, (c) sonikasyon yoluyla çalkalama (genellikle vakum altında) ve (d) azot, argon veya helyum ile serpme yoluyla çalkalama (bunların çözünürlüğü düşüktür ancak pahalıdır).

Bu prosedürlerin sıvının bileşimini değiştirebileceği ve bu nedenle karıştırmadan önce gerçekleştirilmesi gerektiği unutulmamalıdır. Gazdan arındırılmış çözücüler havayı çok yavaş emer ve özel önlemler alınmadan kullanılabilir.

Son olarak, çözücülerdeki katı parçacıklar HPLC sistemine çekilirse, pompa valflerinin sızdırmazlığını bozabilir veya kromatografik kolonun tepesini tıkayabilir. Bu nedenle hem pompa öncesi hem de sonrası filtreleme şiddetle tavsiye edilir.

Çözücüler, 5 pm filtreden (çözücüyle uyumlu) çözücü rezervuarına süzülmelidir. Ön pompa filtresi, pompaya giden tüpe takılı bir 5 pm sinterlenmiş filtre olmalıdır. Özellikle pistonlu pompalarda serbest bir çözücü akışını kolaylaştırmak için bunun geniş bir yüzey alanına sahip olması önemlidir. Pompa sonrası filtre, pompa kafasından kolon üzerinde ince döküntülerin birikmesini önleyerek ekstra koruma sağlar.

İzokratik Gradyan Elüsyonu

İzokratik HPLC sistemleri tek bir mobil faz kullanır ve genellikle maliyet, uygunluk ve gelişmiş detektör yanıtları temelinde tercih edilir. Bu, özellikle gradyan sistemlerinin kullanımının genellikle engellendiği kırılma indisi veya elektrokimyasal dedektörler için geçerlidir. Ek olarak, izokratik elüsyonlar her çalışmadan sonra kolonun yeniden dengelenmesini gerektirmez ve hem zamandan hem de solventten tasarruf sağlar.

Gradyentin izokratik sistemlere göre ana avantajları, hem yüklenen tüm bileşenlerin ayrıştırıldığından emin olmak hem de daha sonraki ayrıştırma piklerinin tutma sürelerinin aynı olduğundan emin olmak için bir dizi çözücü kuvvetinin gerekli olabileceği bilinmeyen veya çok bileşenli örneklerin analizinde sağlanır.

Gradyan sistemleri iki sınıfa ayrılabilir; çözücülerin pompadan önce karıştırıldığı yerler (düşük basınçlı sistemler) ve çözücülerin pompadan sonra karıştırıldığı yerler (yüksek basınçlı sistemler).

Düşük basınçlı sistemler

Düşük basınçlı sistemlerde gradyan, pompadan önce oluşturulur ve pompa kafasının ölü hacmi ile belirlenen darbeler halinde kolona iletilir. Ana avantajı, nispeten düşük maliyettir. Düşük basınç gradyanı oluşturmak için tasarlanmış basit bir sistem tanımlanmıştır, ancak her zaman iyi bir yeniden üretilebilirlik sağlamaz. Ticari sistemler vanaları değiştirmeye dayanır, ancak bileşenlerden birinin% 5’inden daha azı teslim edilirken yanlışlıklar meydana gelebilir.

Yüksek basınçlı sistemler

Yüksek basınçlı gradyan sistemleri, çıkışı genellikle bir mikro işlemci tarafından kontrol edilen iki pompa kullanır. Bu sistemler genellikle, doğru ve tekrarlanabilir gradyanların oluşturulmasına izin veren bir karıştırma odası gerektirir. Aşırı dedektör gürültüsünü en aza indirmek için mobil fazların tamamen karıştırılmasının önemli olduğu unutulmamalıdır.

Örnek hazırlama

Ham biyolojik bir numunenin bir HPLC kolonuna doğrudan enjeksiyonu büyük sorunlara neden olabilir ve genellikle analizden önce bir tür numune temizliğinin yapılması önemlidir. Numunenin kısmen saflaştırılamaması, partikül maddenin HPLC sistemine girmesine ve ayrıca çözünür bileşenlerin sabit faza geri çevrilemez şekilde bağlanmasına izin verebilir.

Proteinlere veya nükleik asitlere bağlanan bazı bileşikler, ekstraksiyonlarına izin vermek için asit veya baz hidrolizine ihtiyaç duyabilmesine rağmen, bir ilk temizleme ve ekstraksiyon adımı genellikle numune homojenleştirmesini içerir. Enzimatik hidroliz, daha hafif ancak daha yavaş bir alternatif sağlar.

Hidroliz, biyolojik bir numunedeki istenmeyen proteinleri uzaklaştırmak için perklorik asit kullanılarak protein denatürasyonu ve çökeltme ile birleştirilebilir. Alternatif olarak protein, diğer asitlerin, tuzların (örn. Amonyum sülfat), çözücülerin eklenmesiyle veya yarı geçirgen bir membrandan ultrafiltrasyon yoluyla çıkarılabilir.

Bu aşamada, ilgilenilen bileşiklerin yeterli konsantrasyonda mevcut olması koşuluyla, bunlar HPLC kolonuna enjekte edilebilir.

Aksi takdirde, ekstraksiyon yoluyla bir miktar konsantrasyon gereklidir ve bu, doğrudan buharlaştırma (örn. Nitrojen veya vakum) yoluyla numune hacminin azaltılması veya karışımdaki daha lipofilik bileşenlerin çözücü ekstraksiyonu yoluyla veya dolaylı olarak ilk önce pH’ın ayarlanmasıyla gerçekleştirilebilir.

Daha sonra sulu bir faza nötrleştirme ve geri ekstraksiyon gerçekleştirilebilir. Alternatif olarak, bileşikler artık özel kolonlar tasarlanmış olan kolon kromatografisi ile ekstrakte edilebilir ve konsantre edilebilir. Ekstraksiyon prosedürleri sırasında kullanılan fazla tuzların kolon ömrünü korumak için uzaklaştırılması önemlidir.

Son adım olarak, numune uygun bir çözücü (tercihen HPLC mobil faz) içinde çözülmeli ve HPLC kolonuna enjeksiyondan önce santrifüjlenmeli veya filtrelenmelidir. İlgi konusu bileşiklerin konsantrasyonu saptamaya izin vermek için yetersizse, numune türevlendirme gerektirebilir.

The post Çözücü Saflığı – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).