4-hidroksi-3-met-ilfeniletilenglikol, 4-hidroksi-3-metoksifenilasetik asit ve 5-hidroksiindol-3-asetik asit dahil olmak üzere biyojenik aminlerin diğer birkaç metabolitinin tespiti de +0,80 V elektrot potansiyeli kullanılarak tespit edilir. Ag-AgC1 referans elektrodudur.

Geleneksel amperometrik elektrokimyasal detektörler kullanılarak biyojenik aminler için minimum tespit limitinin genellikle 10-100 pg aralığında olduğu kabul edilir. Elektrokimyasal tespitte nispeten yeni bir gelişme, farklı potansiyellerde çalıştırılan iki çalışma elektrotu (anot ve katot) kullanan ikili elektrokimyasal detektörlerin kullanılmasıdır.

Daha yakın zamanlarda, katekolaminleri zenginleştirmek için bir ön kolon ile birlikte mikro-delikli HPLC’de kullanılmak üzere tasarlanmış bir ikili elektrokimyasal detektörün noradrenalin ve adrenalin için minimum tespit limitlerini yaklaşık 3 pg’ye düşürdüğü bildirilmiştir.

Bununla birlikte, daha önce açıklanan çok hassas algılama sınırlarının yalnızca optimum dedektör koşulları altında elde edilebileceği unutulmamalıdır. Mobil fazın iyonik kuvvetinin, detektör yanıtında önemli bir parametre olduğu ve sulu bir ortamda 0.07 M’lik bir tuz konsantrasyonunda optimal olduğu gözlenmiştir.

Mobil fazdaki metanol konsantrasyonu, tespit hassasiyetini de etkileyebilir ve 0.04 M’nin altındaki tuz konsantrasyonlarında metanol varlığının detektör hassasiyetini önemli ölçüde azalttığı bildirilmiştir.

Katekolaminlerin florimetrik tespiti üç ana sınıfa ayrılır, bunlar doğal florimetri, kolon öncesi türevlendirme ve kolon sonrası türevlendirme. Doğal floresan, doğal biyojenik amin moleküllerine özgü floresans özelliklerini kullanır.

Katekolaminler, 310-330 nm’de maksimum emisyon ile 200-220 nm ve 280-300 nm’de eksitasyon maksimumuna sahipken, indoller 210-220 nm ve 270-280 nm’de eksitasyon maksimumuna ve yaklaşık 360 nm’de bir emisyon maksimumuna sahiptir.

Kemilüminesans yöntemi
Kemilüminesans yöntemi pdf
Spektrofotometre absorbans değerleri
Moleküler floresans spektroskopisi
Floresans Nedir
Lüminesans Nedir
Floresans spektroskopisi pdf
Floresans spektroskopisi çalışma prensibi

Doğal floresans kullanan katekolaminler için minimum tespit limitlerinin genellikle 100-300 pg aralığında olduğu ve serotonin için (20 pg) daha düşük olduğu kabul edilir. Bununla birlikte, diğer çalışanlar, bir dizi dopamin metabolitleri için yaklaşık 20 pg’lik tespit limitleri talep ettiler.

Kolon öncesi türevlendirmede, biyojenik amin başlangıçta bir türevlendirme ajanı ile birleştirilerek, gelişmiş flüoresansa sahip bir eklenti üretilir. Katkı daha sonra özümlenir ve kromatografiye tabi tutulur.

En yaygın olarak kullanılan türevlendirme reaktifi o-ftalaldehittir (OPA), ancak dansil klorür ve floreskamin de kullanılmıştır. OPA türevlerinin önemli bir avantajı, 2-8 ° C’de etil asetat içinde saklandığında 100 saatten fazla olduğu gösterilen bilinen stabilitesidir.

Kanda, beyin dokusunda ve idrarda bulunan biyojenik aminlerin OPA türevlerinin iyi kromatografik ayrımları bildirilmiştir. OPA türetmesi kullanılarak plazma ve dokudan biyojenik aminler için minimum saptama sınırlarının 50-100 pg aralığında olduğu kabul edilir.

Daha yakın zamanlarda, sürekli dalgalı bir argon lazeri, gelişmiş algılama hassasiyeti sağlamak için bir uyarım kaynağı olarak kullanılmıştır ve noradrenalin ve dopamin için sırasıyla 5 pg ve 16 pg limitleri talep edilmiştir.

Biyojenik aminlerin saptanması için kolon sonrası türevlendirme teknikleri, florimetrik saptamadan önce bir flüoresan eklentisi oluşturmak için biyojenik aminlerin ilk kromatografik ayrılmasına ve ardından on-line türevlendirmeye dayanır.

En sık kullanılan türetme yöntemleri arasında trihidroksiindol (THI) yöntemi ve o-ftalaldehit (OPA) yöntemi yer alır, ancak son zamanlarda etilendiamin glisilglisin ve 2-siyanoasetamid de kullanılmıştır.

Katekolaminlerin HPLC analizi için THI yöntemi orijinal olarak Mori (1974) tarafından geliştirilmiştir ve son metodolojik gelişmelerle dokularda ve idrarda 20-30 pg noradrenalin minimum saptama limiti bildirilmiştir.

THI yönteminin, doku örneklerinde katekolaminlerin saptanması için OPA yönteminden daha seçici olduğu bildirilmiştir, bu da endojen materyalin ko-kromatografi ile daha az reaksiyon olduğunu düşündürmekle birlikte, OPA yönteminin tercih edildiğine dikkat edilmelidir. 

Algılama hassasiyetinin sınırlayıcı bir faktör olduğu uygulamalarda genellikle kullanılmasa da, 280 nm dalga boyunda UV saptaması kullanılabilir. Noradrenalin, DOPA ve dopaminin belirlenmesi için minimum saptama limitlerinin 5 ile 10 ng arasında olduğu belirtilmiştir, yani doğal floresans sistemleri kullanılarak elde edilebilenin yaklaşık yarısına eşittir.

İncelenen tespit tekniklerinden elektrokimyasal ve doğal floresan, maliyet, bakım kolaylığı ve numune hazırlama süresi açısından genel olarak karşılaştırılabilir. Türetme gerektiren floresans metodologları, bireysel sistemlerle ilişkili spesifik problemlerle oldukça karmaşıktır.

Örneğin, kolon öncesi türevlendirme ile bir ilk kimyasal reaksiyon gerçekleştirilmeli ve daha sonra türev, kromatografik analiz için reaksiyon karışımından ekstrakte edilmelidir.

Sütun sonrası türetmede, kromatografik sistemin kolon ve detektör arasındaki ölü boşluğu en aza indirmek için dikkatlice düzenlenmesi gerekir; türetme reaksiyonunun tamamlanması için yeterli süreye de izin verilmesi gerekir.

Tespit hassasiyeti açısından, elektrokimyasal dedektörlerin noradrenalin, DOPA ve dopaminin tespiti için doğal floresan kullanan sistemlerden yaklaşık dört kat daha hassas olduğu önerilmektedir.

Bununla birlikte, bazı bileşikler için doğal flüoresans, elektrokimyasal saptamadan eşit veya daha fazla hassasiyet sağlar. Örneğin, elektrokimyasal saptama homovanillik asidin ölçümü için floresandan daha duyarlı iken, Shy-droxyindoleacetic asit için eşit derecede duyarlıdır ve triptofan ölçümü için daha az duyarlıdır.

Belirli bileşiklerin ölçümü için hem kromatografik sistemin hem de kullanılan detektörün dikkatlice değerlendirilmesi gerektiği bilinmelidir. Örneğin, elektrokimyasal detektörler genellikle numune enjeksiyonundan sonra büyük bir solvent cephesi gösterir.

Bu sorun, elektrokimyasal detektörlerin çözücü sisteminin bileşimindeki değişikliklere olan duyarlılığından kaynaklanmaktadır ve pratik olarak bu, kısa tutma sürelerine sahip bileşiklerin çözücü cephesine gömülebileceği anlamına gelir.

Sonuç olarak, katekolaminlerin kantitasyonu için seçilen spesifik detektör, sistemin kullanılacağı spesifik uygulamaya çok bağlıdır.

Yüksek hassasiyet gerektiren sistemler için elektrokimyasal veya floresans türevlendirme sistemleri muhtemelen optimaldir. Duyarlılık bir sorun değilse, o zaman açıkça dedektör seçimi daha geniştir ve seçilen sistem elektrokimyasal, doğal floresan ve hatta UV saptamasını kullanabilir.

Vitaminler

Vitaminler, suda çözünebilen veya yağda çözünebilen olarak iki gruba ayrılmaktadır. Geleneksel saflaştırma yöntemleri, çok düşük vitamin içeriği nedeniyle büyük miktarlarda dokunun ilk ekstraksiyonunu gerektirdi ve bu nedenle aşağıdaki kriterleri karşılayan alternatif bir yaklaşım gerekliydi:

(1) Eser miktarları önemli bir kayba neden olmadan işleme yeteneği.
(2) Hız.
(3) Isı, UV ışığı ve oksidasyon kaynaklarından kaçınabilir.
(4) Pek çok vitamin yararlı kromoforlar içermediğinden, oldukça hassas bir tespit sistemine uygun şekilde birleştirilmiştir.

The post Florimetrik Tespit – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).