Uygun şekilde etiketlenmiş ürünler daha sonra sıralanır. CDNA sekansı, “vahşi tip” bir HIV suşu ile hizalanır ve tek tek veya çoklu ilaç kombinasyonlarına direnç gelişimi ile ilişkili nokta mutasyonlarının ve nokta mutasyon kombinasyonlarının belgelendiği bir veri tabanı ile karşılaştırılır.

Tescilli veri tabanları, ticari test tedarikçileri tarafından tutulur veya Stanford Üniversitesi HIV RT ve Proteaz Veri Tabanı gibi açık erişimli uluslararası ortak veri tabanları aracılığıyla sağlanır.

Hepatit C virüsü veya HIV gibi RNA virüslerinin incelenmesinde, plazmadan ekstrakte edilen RNA ters kopyalanır ve cDNA, PCR ile büyütülür. Dizi daha sonra birkaç farklı şekilde incelenebilir. Hepatit C genotiplemesi için ticari olarak temin edilebilen InnoLipa ​​yönteminde, denatüre cDNA, hepatit C virüsünün ayrı genotiplerinde mevcut dizilere karşılık gelen oligonükleotidlerin bağlı olduğu nitroselüloz şeritleri ile hibritlenir. PCR reaksiyonunda kullanılan oligonükleotid primerlerinden biri, bir biyotin molekülü ile etiketlenmiştir.

cDNA’nın bağlanma modeli daha sonra hareketsizleştirilmiş cDNA’nın bir avidin-enzim kompleksi ile reaksiyonu ve ardından bir kromojenik substrat ile ortaya çıkar; şerit üzerinde görünen bant deseni, virüsün genotipini ortaya çıkarır.

HIV-1 ters transkriptaz ve proteazın benzer ticari direnç deneyleri benzer metodolojik prensipleri kullanır, ancak burada nitroselüloz üzerinde immobilize edilmiş oligonükleotit probları, HIV-1’in proteaz veya RT genlerindeki direnç mutasyonlarını seçmek için tasarlanmıştır.

Bununla birlikte daha yaygın olarak cDNA, 20,30-dideoksinükleosit trifosfatların (ddNTP’ler) varlığında başka bir PCR’de etiketlenir. Deoksinükleotid trifosfatların (dNTP’ler) ve ddNTP’lerin özenle optimize edilmiş bir karışımı, geleneksel bir PCR’de oligonükleotitlerle birlikte kullanılır.

Yeni iplik sentezi, her biri etiketlediği baza özgü bir boya ile etiketlenmiş bir ddNTP’nin dahil edilmesiyle rastgele sonlandırılır. Sıralama reaksiyonunun sonunda reaksiyon tüpü, kısmen sentezlenmiş DNA kopyalarının bir karışımını içerecektir. Her birinin ortak bir 50 ucu olacaktır (reaksiyonda kullanılan primer oligonükleotit tarafından tanımlanır), ancak 30 ucunda 1 baz uzunluğu ile değişen farklı uzunluklarda olacaktır.

Karışım, poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ve florometri veya yüksek verimli otomatik kapiler jel dizilimi kullanılarak analiz edilir. İkinci yöntemde, etiketli DNA’nın en küçük parçaları en yüksek mobiliteye sahiptir ve ilk olarak kapilerden ayrıştırılır.

dna dizi analizi 1-5 reaksiyon nedir
Dna dizi analizi ne demek
Dna dizi analizi ne ise yarar
Dna dizi analizi 1 10 çift pozitif ne demek
Dna dizi analizi testi
dna dizi analizi 1-10 çift nedir
dna dizi analizi 1-10 çift pozitif
dna dizi analizi 1-5 reaksiyon ne demek

Kılcal damardan sonradan ayrılan her parça, kendisinden öncekinden bir baz daha uzundur. Ayrılan DNA parçaları bir lazerle uyarılarak ortaya çıkar. 20 30 terminatör bazına eklenen boyaların her biri farklı bir dalga boyunda ışık yayar, bu da ayrı sonlandırma bazının ayırt edilmesini sağlar. Dört rengin tümü ve dolayısıyla bazlar kolaylıkla ayırt edilebilir. Parçanın dizisi, doğrudan kapiler elüattan okunur.

Bu prosedüre alternatifler, cam slaytların, silikon gofretlerin veya ekli oligonükleotitlere (DNA mikroçipler) sahip naylon membranların kullanımını içerir. HIV-1 genotiplemesi için, HIV-1 proteaz geninin tam gen dizisini ve RT geninin 1200 baz çifti bölgesini analiz etmek için bir dizi geliştirilmiştir.

Çip, bu sekans içindeki tüm olası mutasyon kombinasyonlarını kapsayacak şekilde tasarlanmış 18-22 baz çiftli 18.000 prob içeriyordu. Analiz edilecek dizideki her nükleotit, o konumdaki nükleotidin A, T, C veya G olup olmadığını belirlemek için en az dört oligonükleotit probu gerektirir. Diziyi kullanmak için, bir RT PCR’den elde edilen cDNA Plazma kaynaklı virüsün bir kısmı, tek iplikli RNA’ya kopyalanır ve floresan haberci moleküllerle etiketlenir.

Hibridizasyondan sonra çip, floresan etiketi ve konfokal mikroskopla inceleme ile ortaya çıkan bağlanma modelini etkinleştirmek için bir lazer kullanılarak taranır. Haberci moleküller, probun nükleik asidi bağladığı sıkılıkla orantılı olarak floresan verir.

Hiçbir nükleik asit bağlamayan sondalar floresan yaymazken, tek bir baz çifti uyuşmazlığı ile bağlanan sondalar, tam dizi eşleşmesi olduğunda 35 kata kadar daha az floresansa sahiptir. Gözlemlenen bağlanma modelinin bilgisayar destekli dekonvolüsyonu, çip üzerinde temsil edilen HIV-1 RNA vahşi tip dizisinden diziyi belirlemek için örtüşen problardan türetilen dizilerin bağlanmasına izin verir.

HIV’in genetik çeşitliliği, DNA çiplerinin kullanımında aşırı bir zorluk teşkil ediyor. Dideoksinükleotit dizilimi ile karşılaştırıldığında, çipin mutasyon tespitinde daha az güvenilir olduğu ve dizi ekleme veya silmelerini ayırt etmede daha az yetenekli olduğu bulundu.

Çip ayrıca, çipin tasarlandığı alt tip olan HIV-1’in alt tipi olmayan B suşlarını sıralarken daha az iyi performans gösterdi. Bu gerilemeye rağmen, DNA mikroçiplerinin çok yönlülüğü ve yüksek verim yetenekleri, ticari gelişimlerinin devam etmesine yol açmıştır ve hepatit B ve hepatit C virüslerinin genotipik analizine yönelik çipler ticari olarak piyasaya sürülmeye yaklaşmaktadır.

Bu teknolojinin daha geniş kullanımına yönelik ilginç bir yaklaşım, kelimenin tam anlamıyla yüzlerce farklı insan virüsünü tespit edip tanımlayabildiği gösterilen uzun bir oligonükleotit (70-mer) DNA mikrodizisinin tanımıdır.

Bu teknoloji ile bağlantılı olarak rastgele bir ters transkripsiyon PCR kullanılarak, diziye özgü veya dejenere primerlere dayalı olarak PCR kullanılmadan solunum örneklerinde çoklu virüsleri saptamak mümkün olmuştur.

NOT: Sıralama. HIV-1 proteaz ve RT genlerinin dizilenmesini gösteren bir örnek. Kılcal sıralayıcıdan ayrıştırılan bazlar, renk kodludur (mavi, sitozin; siyah, guanin; kırmızı, timin; yeşil, adenin), sekansın birleştirilmesine ve bir HIV-1 vahşi tip suşun sekansı ile karşılaştırılmasına izin verir. Antiviral ilaç direncinin gelişimi ile ilişkili olabilecek virüsün test suşu içindeki baz değişikliklerini belirler.

Özet

Virolojide ve özellikle klinik virolojide moleküler biyolojik tekniklerin uygulama patlaması hız kazanmaya devam ediyor. Moleküler tanı yöntemleri, hücre kültürü izolasyonu, seroloji, floresan mikroskobu ve elektron mikroskobu gibi geleneksel tanı yöntemlerinin yerini hızla almaktadır.

Otomasyon, tekrarlanabilirliği ve güvenilirliği artırırken testin teknik karmaşıklığını azaltmaktadır. Uygulamaları, klinik virolojiyi bir adım öteye taşıdı.

The post Diziler – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri first appeared on Online (Parayla Ödev Yaptırma).